Neuroscience
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generering av mänskliga motorenheter med funktionella neuromuskulära korsningar i mikrofluidiska enheter
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metod för att generera mänskliga motor enheter i kommersiellt tillgängliga microfluidic enheter genom samodling mänskliga inducerad pluripotenta stamcell-härledda motor nervceller med mänskliga primära mesoangioblast-härledda myotubes som resulterar i bildandet av funktionellt aktiva neuromuskulära korsningar.
Transcript
Denna relativt enkla metod kan hjälpa forskning med fokus på motoriska nervceller och neuromuskulära korsningar i hälsa och sjukdom. Detta protokoll använder standardstamcellsteknik och kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter som ökar reproducerbarheten. Frånkoppling av motoriska nervceller och muskelceller är ett tidigt fenomen i flera neuromuskulära sjukdomar.
En enkel humaniserad modell kan bidra till att utveckla strategier för att motverka detta fenomen. Vi använder denna modell för att undersöka motor neuron störning, amyotrofisk lateral skleros, men denna modell kan också användas för andra sjukdomar där motorenheten är avgörande. Börja med att överföra enheten med tången från fraktbehållaren till Petri-skålen som innehåller 10 milliliter 70% till 100% etanol för sterilisering i 10 sekunder.
Överför enheten med tång till ett papper för att lufttorka i Laminar Flow i ca 30 minuter. När en enhet har torkats, använd tång för att flytta varje enhet till en individuell 10 centimeter Petriskål. För att belägga enheten med Poly-L-ornitin eller PLO, tillsätt 100 mikroliter PLO-lösning till toppen och observera vätskan som passerar från toppen väl genom kanalen till bottenbrunnen.
Tillsätt sedan 100 mikroliter PLO-lösning till bottenbrunnen och upprepa på andra sidan av mikrospåren. Avsluta med att lägga till 100 mikroliter PLO-lösning på ena sidan för att skapa en volymgradient mellan enhetens två speglade sidor för att belägga mikrospåren. Inkubera i tre timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.
Tvätta enheten tre timmar efter tre timmar i fem minuter med DPBS. Täck enheten med 20 mikrogram per milliliter laminin och neurobasal medium genom att följa proceduren som liknar PLO-beläggning. Inkubera enheten över natten vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.
Följande dag använd en 200 mikroliter pipett och placera spetsen i brunnen mittemot kanalöppningen för att ta bort lamininbeläggningen från brunnarna. Efter att ha lagt till DPBS i alla brunnar, lämna enheterna med DPBS i Laminar Flow vid rumstemperatur för cellsådd. Kapa SCM-arken till enhetens storlek samtidigt som du lämnar några millimeter på varje sida.
Efter sterilisering av enheterna och SCM-arken i en Petri-skål som innehåller 10 milliliter 70 till 100% etanol i 10 sekunder, överför enheterna med tång till en sexbrunnplatta och SCM-arken till en 10 centimeter Petriskål för lufttorkning i Laminar Flow. Placera enheten på kanten så att alla sidor torkar i ca 30 minuter. Täck enheterna genom att tillsätta en milliliter PLO-lösning per brunn till varje enhet i sexbrunnsplattan.
Se till att enheten flyter ovanpå PLO-lösningen med kanal- och mikrospårsidan vänd nedåt i vätskan. Täck SCM-arken genom att tillsätta 10 ml PLO-lösning till 10 centimeter Petriskålen och använd tångarna för att trycka ner SCM-arken i vätskan. Inkubera enheter och SCM-ark i tre timmar, vilket visats tidigare.
Efter tre timmar tvättar du enheterna och SCM-arken två gånger i fem minuter med DPBS följt av ytterligare en tvätt i fem minuter med sterilt vatten. Överför sedan varje SCM-ark till en individuell 10 centimeter Petriskål för att lufttorka. När du arbetar under ett mikroskop i Laminar Flow, använd tång för att montera silikonanordningen med kanal- och mikrospårsidan nedåt i 90 graders vinkel på SCM-arket och se till att alla sidor är justerade.
Tryck lätt ner på enheten för att se till att försegla inte bara ytterkanter, men också runt brunnar, kanaler och mikrospår. För att belägga enheten med laminin, inuti Laminar Flow och under mikroskopet, tillsätt 100 mikroliter av 20 mikrogram per milliliterlösning av laminin i toppbrunnen med en 200 mikroliterpipett. Observera vätskan som passerar från toppen väl genom kanalen till bottenbrunnen utan läckage runt brunnen och kanalen.
Lägg därefter till 100 mikroliter lamininlösning till bottenbrunnen, upprepa på andra sidan av mikrospåren och avsluta med ytterligare 100 mikroliter laminin på ena sidan för att skapa en volymgradient mellan enhetens två speglade sidor för att täcka mikrospåren och inkubera sedan enheten över natten. Följande dag, ta bort beläggningen från brunnarna med 200 mikroliterpipetten genom att placera spetsen i brunnen mittemot kanalöppningen, efter att ha lagt till DPBS till alla brunnar, lämna enheterna med DPBS i Laminar Flow vid rumstemperatur för cellsådd. För att plätera neurala stamceller eller NPC: er i den mikrofluidiska enheten, ta bort DPBS från två brunnar på ena sidan av mikrospåren i enheten med hjälp av en 200 mikroliter pipett.
För att så totalt 250 000 NPC och 60 till 100 mikroliter dag 10 motor neuron medium per enhet, i den övre högra brunnen, frö hälften av cellfjädringen nära kanalöppningen i en vinkel på 45 grader. Pausa i några sekunder så att cellupphängningen kan flöda genom kanalen innan du lägger till den återstående halvan av cellupphängningen i den nedre brunnen. Använd en penna för att markera den sådda sidan som NPC eller motsvarande, för enkel orientering av enheten utan mikroskop, och inkubera i fem minuter för cellfäste.
Fyll sedan långsamt på de två NPC-sådda brunnarna med ytterligare en dag 10 motor neuron medium till en total volym på 200 mikroliter per brunn. Använd en 200 mikroliter pipett, ta bort DPBS från de två brunnarna på andra sidan av mikrospåren mittemot de nysådda NPCs.
Tillsätt sedan sex milliliter DPBS per 10 centimeter skål runt enheten för att förhindra avdunstning av mediet under inkubation. För att ändra mediet, ta långsamt bort media i båda brunnarna med NPC: er genom att placera 200 mikroliter pipetterspetsen vid bottenkanten av brunnsväggen mittemot kanalöppningen. För att förhindra att ett starkt mediumflöde skadar cellerna på kanalen, tillsätt långsamt 50 till 100 mikroliter av färsk motorisk neuronmedium till varje brunn genom att kontinuerligt byta mellan toppen och bottenbrunnen.
Upprepa processen tills varje brunn innehåller 200 mikroliter medium. På dag 17 av motorisk neurondifferentiering, ta bort motorneuronmediet på den osedda sidan av mikrospåren i enheten med en 200 mikroliter pipett och tvätta brunnarna med DPBS. Frö totalt 200 000 mänskliga primära mesoangioblaster eller MAB, i 60 till 100 mikroliter tillväxtmedium per enhet genom att så hälften av cellfjädringen i den övre brunnen.
Pausa i några sekunder för att låta cellfjädringen flöda genom kanalen innan du sår den återstående halvan av cellupphängningen i bottenbrunnen, vilket tidigare visats för plätering av NPCs. Inkubera enheten i fem minuter för cellfäste. Fyll sedan på de två nytillsädda MAB-sådda brunnarna med ett extra tillväxtmedium och inkubera igen som visats.
För att initiera kemo taktik och volymetrisk gradient på den 21: a dagen av motor neuron differentiering, lägg till 200 mikroliter per brunn av motor neuron neurobasal medium som innehåller tillväxtfaktorer till Myotube facket, sedan lägga till 100 microliters per brunn av motor neuron basal medium utan tillväxtfaktorer till motor neuron facket. Det är viktigt att bedöma differentieringspotentialen hos cellinjerna innan de samkulteras i mikrofluidiska enheter. Fusionsindexet för MAB fastställdes och cirka 8% uppskattades vara tillräckligt för samkultur.
De genererade motor neuron kulturer var 85 till 95%positiva för motor neuron markörer. För att karakterisera och kvantifiera mängden neuromuskulära korsningar eller NMJs, antalet co-localizations mellan motor neuron och pre-synaptic markörer neurofilament tung kedja och synaptophysin och postsynaptic acetylen receptor markör alfa bungarotoxin, räknades genom varje sjukdom stack och normaliserades vid ett antal myosin-tunga kedjan märkt Myotubes närvarande i Z-stack. NMJs uppträdde som enda kontaktpunkt NMJs där neurit berörde ett kluster av en subtil kolin receptor vid en interaktion punkt.
Eller som flera kontaktpunkt NMJs där en neurit fann ut och engagerade med en subtil kolin receptor kluster över en större yta. Kvantifiering av andelen motor neuron innoverade Myotubes indikerade att inte alla Myotubes innehöll NMJs. Vid motor neuron aktivering med kaliumklorid observerades kalcium tillströmningen i Fluo-4 märkt Myotubes, som bekräftade en funktionell anslutning till motor neuron neurit i Myotube, tillsats av NMJ blockerare d-tubocurarine eller DTC till Myotube facket resulterade i en hämning av kalcium tillströmning.
För att ha den största framgången med denna modell är det oerhört viktigt att utföra en celllinjekvalitetskontroll och för att undvika bildandet av luftbubblor i enhetens kanaler. Att kombinera den neuromuskulära korsningen i en maträtt med andra IPC-direkta celltyper efterliknar ännu bättre in vitro-situationen, detta gör det också möjligt att studera rollen för dessa celltyper.
Tags
Neurovetenskap nummer 175Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
