Live-Cell Imaging av transkriptionell aktivitet vid DNA Double-Strand Breaks

Detta protokoll gör det möjligt att observera och upptäcka transkriptionshändelser och ger insikter om effekterna av DNA dubbelsträngsbrytningar på den pågående transkriptionen av en gen. Den största fördelen med tekniken är observationen av individuellt märkta RNA-transkriptioner i enstaka celler med tidsintervall på sekunder under en total period på en timme eller mer. Denna metod ger insikt i DNA-skador svar för att undersöka korstalk mellan transkription och cellulära processer, såsom DNA-replikering och DNA-skador.

Vårt råd är att observera celler som använder doxycyklin och att utföra kalibreringsmätningar för att träna detektion av transkriptionsplatsen och märkta RNA-molekyler. I ett 1,5 milliliter mikrocentrifugerör bereder du lösning A som innehåller 150 mikroliter reducerat serum MEM plasma-DNA och 2,5 mikrogram per mikroliter DNA i reagens för transfekthjälpmedel. Förbered samtidigt lösning B som innehåller 150 mikroliter reducerat serum MEM och 1,5 mikrogram per mikroliter DNA i ett lipidbaserat transfektreagens.

Inkubera båda lösningarna vid rumstemperatur i fem minuter, tillsätt sedan försiktigt lösning A till lösning B och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. För att transfektera cellerna, tillsätt 300 mikroliter blandad lösning A och B droppvis till varje maträtt och fördela den försiktigt. Förvara glasbottenskålen i en 100 millimeter vanlig cellodlingsfat och inkubera den vid 37 grader Celsius i en fuktad atmosfär med 5% koldioxid.

Förbered 1,5 milliliter mikrocentrifugerör med 200 mikroliter DMEM med HEPES utan fenolrött och kompletterat med 10% kol-strippat fetalt bovinserum och tillsätt sedan TA. Ungefär en timme innan du påbörjar mikroskopiobservation, inducera transkription av reportergenerna genom att tillsätta doxycyklin till tillväxtmediet och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner med en 200 mikroliter mikropipette. Transportera cellerna till mikroskopet minst 30 minuter innan observationen påbörjas och placera 100 millimeters skålen med cellerna inuti den förvärmda stora mikroskopinkubationskammaren. Placera mikrocentrifugeröret med den förspädda TA inuti den stora mikroskopmiljökammaren för att värma den till 37 grader Celsius.

Byt ut locket på glasbottenskålen mot ett lock som har ett borrat hål med tre millimeters diameter. Välj 100X oljesänkningsmål i mikroskoppanelen och applicera en droppe nedsänkningsolja på målet. Ställ glasbottenskålen med cellerna inuti mikroskopets inkubationskammare och lås den på plats och stäng sedan locket på sceninkubatorn och alla dörrar i mikroskophuset.

Starta mikroskopets drift- och kontrollprogramvara, öppna fokuskontrollfönstret och klicka på omfångsfönstret. I rutan för val av utsläpp klickar du på 100% ögonruta för att ställa in okulärstrålebanan för direkt provobservation med öga. Växla till ögonfilteruppsättning på filtermenyn och klicka på Brightfield och tryck sedan på den öppna Brightfield-knappen.

Flytta mikroskopmålet mot glasbottenskålen tills oljan vidrör glaset. Titta igenom okularerna och fokusera manuellt på cellernas plan och stäng sedan av den öppna Brightfield-knappen. Lämna cellerna i 30 minuter innan de experimentella observationerna påbörjas så att de kan anpassa sig till miljöförhållandena och förhindra fokal drift under avbildning på grund av temperaturgradienter.

Ställ in en 200 mikroliter mikropipette och 200 mikroliterfilterspetsar vid rumstemperatur. I mikroskopkontrollprogramvarans fokuskontrollfönster ställer du in laserintensiteten på 5 % och anger ett värde på 50 millisekunder för exponeringstiden. Öppna inspelningsfönstret för att justera inställningarna för att utföra en automatiserad bildförvärv av tredimensionella timelapses.

Välj 3D-insamlingsförvärvstypen och ställ in 12 till 16 optiska skivor åtskilda med 0,4 mikrometer. Markera kryssrutorna för området runt aktuell och återgå till aktuell position efter fångsten. Ange värdet 120 för antalet tidspunkter och 30 sekunder för intervallet i fönstret timelapse.

Välj det konfokala filteruppsättningen enligt de transected fluorescerande proteinetiketterna som nämns i textmanuskriptet och ställ in exponeringstiden för varje kanal till 50 millisekunder. Använd inställningsströmmen för lasereffekten om du vill använda värdet 5 % som valts i fokusfönstret. I fokuskontrollfönstret går du till kamerafönstret, väljer skalbildvisningskontrollen och väljer den manuella knappen för att ställa in ett fast intervall med bildintensiteter som ska visas.

Välj cellerna för 3D-timelapse-avbildning av transkriptionsplatser vid induktion av en DNA-dubbelsträngsbrytning. Screena cellerna och markera tre synfält enligt de villkor som beskrivs i diskussionen om texten. Fokusera varje markerad cell som tidigare fanns i mitten av synfältet med transkriptionsplatsen i Z-stackens mittplan.

Markera varje XYZ-position i XY-planet i fokuskontrollfönstret genom att klicka på börspunkten. Tillsätt 200 mikroliter av den förspädda TA till cellerna och starta 3D-tidsseriens avbildning genom att klicka på start i fångstfönstret. Spara bilddata i mikroskopkontrollprogramvarans dataformat på mikroskopstyrningsdatorns hårddisk.

Tillsätt 0,5 mikrogram per milliliter doxycyklin till cellernas tillväxtmedium en timme innan mikroskopibilden påbörjas. Montera glasbottenskålen inuti mikroskopsteginkubationskammaren och förbered bildförvärvet som visats tidigare. Använd samma laserintensitet och exponeringsinställningar som tidigare.

Ställ in inspelningsinställningarna för 2D-tidsserier och ställ in 120 tidspunkter med intervaller på 500 millisekunder på timelapse-fångstpanelen. Skaffa dussintals kalibreringstidsserier från flera positioner för att generera datamängder för att räkna flera hundra enskilda TFI-mätningar av transkriptioner. Med hjälp av detta protokoll erhålls ett diagram som visar antalet fluorescerande märkta reportergenutskrifter över tid med en temporal upplösning på sekunder över perioder på upp till timmar.

Tidskursen för TFI-värden för en PROM reporter gen transkription webbplats märkt av ackumulering av MS2 päls protein märkt med de gröna fluorescerande proteinmolekylerna på gryende transkriptioner visas här. Induktion av en enda DSB i reportergenerna gör det möjligt att studera dess inverkan på den pågående reportergenutskriften och övervakningen av transkriptionshändelser som kommer från DSB-webbplatsen, nämligen breakinducerad transkription. TA tillägg och induktion av en DSB leder till en undertryckande av PROM reporter gen transkription efter cirka 11 minuter som inte återställs förrän 60 minuter.

Den fullständiga återhämtningen av PP7-RFP signalen visar break-inducerad transkription initiering. EXON 2 antisense reporter genen visar promotorn-drivna transkriptioner uppsägning, som sedan ersätts av antisense break-inducerad transkription som avslöjas av ackumulering av MS2 kappa protein märkt med ett rött fluorescerande protein bindande till RNA genereras från antisense MS2 stam loop sekvenser. Val av celler för avbildning, ställ in den behandlade timelapse imaging justera Z positionen för den märkta transkriptionsplatsen på varje XY position i mitten av Z stacken som ska förvärvas.

Och slutligen måste tillägget av TA utspädd i tillväxtmedium utföras med extrem försiktighet för att förhindra eventuella förskjutningar av de förvalda positionerna med celler som ska avbildas. Avbildning av enstaka RNA-transkriptioner i 3D över tid i levande celler kan tillämpas för att studera RNA-transkription under DNA-replikering eller förändringar av transkription under cellcykelprogressionen.