Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Journal (Immunology and Infection)

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Journal (Immunology and Infection)

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8⁺ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Click here for the English version

Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени

Article DOI: 10.3791/62984-v

October 19th, 2021 •

Kasper Mølgaard*¹, Anne Rahbech*¹, Özcan Met¹, Inge Marie Svane¹, Per thor Straten^1,3, Claus Desler², Marlies J. W. Peeters¹

¹National Center for Cancer Immune Therapy, Department of Oncology, University Hospital Herlev, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, Center for Healthy Aging, University of Copenhagen, ³Department of Immunology and Microbiology, Inflammation and Cancer Group, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 19th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Метаболическая адаптация имеет основополагающее значение для Т-клеток, поскольку она диктует дифференцировку, персистенцию и цитотоксичность. Здесь представлен оптимизированный протокол мониторинга митохондриального дыхания в ex vivo цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека.

Transcript

Митохондриальный метаболизм является важным регулятором прочности и памяти Т-клеток. Таким образом, измерение митохондриального дыхания дает важное представление о свойствах Т-клеток. Машина Seahorse может измерять различные элементы митохондриального дыхания в режиме реального времени в живых первичных Т-лимфоцитах человека без необходимости какой-либо маркировки.

Этот метод очень подходит для мониторинга пригодности Т-клеток и потенциала памяти, которые являются важными предикторами успеха иммунотерапии рака. Для начала промыть шарики CD3/CD28, перенеся 12,5 микролитра бусин на миллион клеток в микроцентрифужную трубку и добавив 12,5 микролитра PBS на 12,5 микролитра шариков в трубке. Затем поместите трубку микроцентрифуги на подходящий магнит на одну минуту, отбросьте буфер и повторно суспендируйте шарики в исходном объеме Т-клеточной среды.

Затем добавьте 12,5 микролитров бусин на миллион клеток в соотношении от одного до двух бусин к клеткам и разделите ячейки на два состояния с примерно пятью миллионами клеток в каждой. Затем добавьте правильный объем цитокинов к каждому состоянию и перенесите клетки в многолуночные пластины. Инкубируйте клетки в течение трех дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

После трех дней инкубации готовят свежую Т-клеточную среду с удвоенной концентрацией цитокинов. Повторное суспендирование и расщепление клеток путем переноса половины объема из каждой скважины в новую лунку. Затем добавьте в каждую лунку одинаковый объем свежеприготовленной Т-клеточной среды.

Для внеклеточного флюса готовят раствор покрытия, содержащий бикарбонат натрия, Cell-Tak и гидроксид натрия. Затем откройте свежую пластину для культивирования клеток XF и добавьте 12 микролитров свежеприготовленного раствора покрытия в каждую лунку, обеспечив равномерное распределение раствора покрытия на дне всех скважин. Инкубировать пластину при комнатной температуре с крышкой в течение 30 минут.

Затем выбросьте оставшийся жидкий раствор из всех колодцев. Вымойте пластину 200 микролитрами стерильной воды и выбросьте жидкость. Затем промыть пластину 200 микролитрами стерильного PBS клеточного культурального класса.

После выбрасывания жидкости дайте тарелке высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре. Чтобы наложить Т-клетки на пластину культивирования клеток XF, подготовьте 50 миллилитров среды для анализа, смешивая подходящую среду XF RPMI с глюкозой, пируватом и глютамином в соответствии с экспериментальной установкой. Нагрейте подготовленную среду до 37 градусов Цельсия в инкубаторе, не регулируемом углекислым газом, и установите рН на 7,4.

Обеспечьте достаточное количество сред для посадки клеток и приготовления растворов олигомицина и FCCP. Затем разработайте макет пластины с увеличением количества ячеек на скважину для оптимизации или прогона анализа. Используйте четыре скважины, заполненные средой и закачанные средой для фоновых измерений.

После подсчета Т-клеток, приготовленных ранее, пипеткой распределяют соответствующее количество клеток к каждой лунке ранее покрытой пластины для культивирования клеток XF в соответствии с расположением пластины. Чтобы приклеить Т-клетки к покрытой поверхности, центрифугируйте пластину культуры клеток XF. Затем промыть клетки 200 микролитрами пробирной среды.

Отбросьте носитель и добавьте 180 микролитров свежей пробирной среды. Убедившись, что клетки прикреплены и равномерно распределены по поверхности скважины, инкубируйте пластину культуры клеток XF при 37 градусах Цельсия в нагревательном шкафу без углекислого газа в течение 30 минут. Для оптимизации запуска подготовьте рабочие растворы олигомицина и FCCP в пробирных средах.

Затем загрузите рабочие растворы олигомицина или FCCP в отверстия для инъекций картриджа датчика. Убедитесь, что ни одно отверстие для впрыска не содержит только воздух. Заполните все пустые порты пробирными носителями.

Затем удалите потенциальные пузырьки в отверстиях для инъекций, осторожно выбив края пластины на столе. Для проведения анализа приготовьте 20-микромолярный раствор антимицина А. Затем, в соответствии с компоновкой пластины, загрузите 20 микролитров олигомицина или FCCP в инъекционный порт A картриджа датчика и добавьте 22 микролитра антимицина A в инъекционный порт B всех скважин.

В репрезентативном запуске оптимизации олигомицина плато в скорости потребления кислорода, или OCR, достигается, когда аккумулятивная концентрация достигает одного микромоля. Начиная с этой концентрации, OCR не уменьшался дальше. Для клеток, получавших повышенные концентрации разъединителя FCCP, уровни OCR увеличивались до 0,2 микромолярного FCCP, а затем достигали плато, что указывает на получение полного разъединения.

В репрезентативном запуске оптимизации концентрации клеток начальный OCR для прогона с 200 000 клеток составляет примерно половину от этого, с 400 000 клеток. После лечения FCCP максимальный OCR составляет 61,6 пикомолей в минуту для 200 000 клеток и 190,4 пикомолей в минуту для 400 000 клеток. После лечения олигомицином OCR в беге с 200 000 клеток сворачивается в однозначные цифры и ниже, чем в беге с 400 000 клеток.

Исследование влияния цитокинов интерлейкина-2 и интерлейкина-15 на метаболизм Т-клеток выявило, что культивируемые интерлейкин-15 клетки обладали более высоким максимальным дыханием и запасной дыхательной способностью. Однако базальное дыхание и выработка АТФ не пострадали. Изучение митохондриального метаболизма в Т-клетках человека дает важные подсказки об их долговечности и потенциале выживания.

Это приводит к расширению знаний о пригодности Т-клеток и может в конечном итоге улучшить показатели ответа на иммунотерапию рака.

X

Simple Hit Counter