Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Sanntidsovervåking av mitokondrie respirasjon i cytokin-differensierte humane primære T-celler

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Journal (Immunology and Infection)

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Journal (Immunology and Infection)

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Click here for the English version

Sanntidsovervåking av mitokondrie respirasjon i cytokin-differensierte humane primære T-celler

Article DOI: 10.3791/62984-v

October 19th, 2021 •

Kasper Mølgaard*¹, Anne Rahbech*¹, Özcan Met¹, Inge Marie Svane¹, Per thor Straten^1,3, Claus Desler², Marlies J. W. Peeters¹

¹National Center for Cancer Immune Therapy, Department of Oncology, University Hospital Herlev, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, Center for Healthy Aging, University of Copenhagen, ³Department of Immunology and Microbiology, Inflammation and Cancer Group, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 19th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Metabolsk tilpasning er grunnleggende for T-celler da det dikterer differensiering, utholdenhet og cytotoksisitet. Her presenteres en optimalisert protokoll for overvåking av mitokondrie-respirasjon i ex vivo cytokin-differensierte primære T-celler.

Transcript

Mitokondriemetabolisme er en viktig regulator av T-celle holdbarhet og minne. Måling av mitokondrie respirasjon gir derfor viktig innsikt i egenskapene til T-celler. Seahorse-maskinen kan måle ulike elementer av mitokondrie respirasjon, i sanntid, i levende menneskelige primære T-lymfocytter, uten behov for merking.

Denne metoden er veldig egnet for overvåking av T-celle fitness og minnepotensial, som er viktige prediktorer for kreft immunterapi suksess. Til å begynne med, vask CD3 / CD28 perler ved å overføre 12,5 mikroliter per million celler til et mikrocentrifugerør og legge til 12,5 mikroliter PBS per 12,5 mikroliter per perle i røret. Plasser deretter mikrocentrifugerøret på en passende magnet i ett minutt, kast bufferen og resuspend perlene i det opprinnelige volumet av T-cellemedium.

Deretter legger du til 12,5 mikroliter per million celler med et forhold mellom en og to perler og celler, og deler cellene i to forhold med rundt fem millioner celler i hver. Legg deretter riktig volum cytokiner til hver tilstand, og overfør cellene til multi-brønnplater. Inkuber cellene i tre dager ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.

Etter tre dager med inkubasjon, lag fersk T-cellemedium med dobbelt konsentrasjon av cytokiner. Resuspend og del cellene ved å overføre halvparten av volumet fra hver brønn til en ny brønn. Deretter legger du til samme volum nylagde T-cellemedium til hver brønn.

For den ekstracellulære fluksanalysen, lag beleggløsning som inneholder natriumbikarbonat, Cell-Tak og natriumhydroksid. Åpne deretter en frisk XF-cellekulturplate, og tilsett 12 mikroliter av den nylagde beleggløsningen til hver brønn, noe som sikrer jevn fordeling av beleggløsning på bunnen av alle brønner. Inkuber platen ved romtemperatur med lokket på i 30 minutter.

Kast deretter gjenværende væskeløsning fra alle brønnene. Vask platen med 200 mikroliter sterilt vann, og kast væsken. Deretter vasker du platen med 200 mikroliter av cellekulturelt steril PBS.

Etter å ha kastet væsken, la platen tørke i 30 minutter ved romtemperatur. For å plate T-celler i XF-cellekulturplaten, lag 50 milliliter analysemedier ved å blande egnede XF RPMI-medier med glukose, pyruvat og glutamin i henhold til det eksperimentelle oppsettet. Varm opp de forberedte mediene til 37 grader Celsius i en ikke-karbondioksidregulert inkubator, og sett pH til 7,4.

Sikre nok medier til å plante celler og forberede oligomycin- og FCCP-løsningene. Deretter designer du et plateoppsett med et økende antall celler per brønn for optimalisering eller analysekjøring. Bruk fire brønner fylt med medier og injisert med media for bakgrunnsmålinger.

Etter å ha talt T-cellene som er utarbeidet tidligere, pipette et passende antall celler til hver brønn av den tidligere belagte XF-cellekulturplaten i henhold til plateoppsettet. For å feste T-cellene til den belagte overflaten, sentrifugerer du XF-cellekulturplaten. Vask deretter cellene med 200 mikroliter analysemedier.

Kast mediet, og tilsett 180 mikroliter ferske analysemedier. Etter å ha sørget for at cellene er festet og jevnt fordelt over brønnoverflaten, inkuberer du XF-cellekulturplaten ved 37 grader Celsius i det ikke-karbondioksidregulerte varmeskapet i 30 minutter. For optimaliseringskjøringen, forbered arbeidsløsninger av oligomycin og FCCP i analysemedier.

Last deretter arbeidsløsningene til enten oligomycin eller FCCP inn i injeksjonsportene til sensorpatronen. Kontroller at ingen injeksjonsporter bare inneholder luft. Fyll alle tomme porter med analysemedier.

Fjern deretter potensielle bobler i injeksjonsportene ved å banke forsiktig kantene på platen på bordet. For analyseløpet, lag en 20-mikromolar antimycin A-løsning. Deretter, i henhold til plateoppsettet, last 20 mikroliter av enten oligomycin eller FCCP i injeksjonsport A på sensorpatronen, og tilsett 22 mikroliter antimycin A til injeksjonsport B av alle brønner.

I en representativ oligomycinoptimaliseringskjøring oppnås et platå i oksygenforbruk, eller OCR, når den akkumulerende konsentrasjonen når en mikromole. Fra denne konsentrasjonen og fremover ble OCR ikke redusert ytterligere. For celler behandlet med økende konsentrasjoner av uncoupler FCCP, økte OCR-nivåene opptil 0,2 mikromolar FCCP og nådde deretter et platå, noe som indikerer at full frakobling ble oppnådd.

I et representativt cellekonsentrasjonsoptimaliseringsløp er den første OCR for en kjøring med 200 000 celler omtrent halvparten av det, med 400 000 celler. Etter FCCP-behandling er maksimal OCR 61,6 picomoles per minutt for 200 000 celler og 190,4 picomoles per minutt for 400 000 celler. Etter oligomycinbehandling kollapser OCR i løpet med 200 000 celler til enkeltsiffer og er lavere enn det i løpet med 400 000 celler.

Undersøker effekten av cytokiner interleukin-2 og interleukin-15 på metabolismen av T-celler avslørte at interleukin-15 dyrkede celler hadde høyere maksimal åndedrettsvern og ekstra åndedrettskapasitet. Basal respirasjon og ATP-produksjon ble imidlertid ikke påvirket. Å studere mitokondriemetabolisme i humane T-celler gir viktige ledetråder om deres holdbarhet og overlevelsespotensial.

Dette resulterer i økt kunnskap om T-celle fitness og kan til slutt forbedre kreft immunterapi respons rater.

X

Simple Hit Counter