多囊卵巢综合征小鼠模型中肝葡萄糖产生的评价

该程序的目标是确定多囊卵巢综合征或PCOS小鼠模型中的肝葡萄糖产生。葡萄糖代谢失调是PCOS的重要表现，也是其发病机制的关键。因此，涉及评估PCOS中葡萄糖代谢的研究至关重要。

在本研究中，我们讨论了通过气相色谱法，质谱法或GCMS测量M加两个六氘代葡萄糖的富集，稳定的同位素葡萄糖示踪剂，在PCOS小鼠模型中定量肝葡萄糖产生速率的分步说明。该过程涉及创建稳定的同位素葡萄糖示踪剂溶液，使用尾静脉导管放置和在同一小鼠中同时在空腹和富葡萄糖状态下输注葡萄糖示踪剂。手术前一天，在生理盐水中制备稳定的同位素葡萄糖示踪剂。

对于该实验，在富含葡萄糖的条件下测量空腹期间的葡萄糖产生，因此在两种不同的制剂中制备葡萄糖同位素。示踪剂在无菌条件下通过溶解无菌和无热原的六六氘化葡萄糖和无菌0.9%氯化钠溶液与有或不含葡萄糖来制备。第一次注入仅用示踪剂制备。

第二种输液含有示踪剂和非同位素葡萄糖。一旦溶液被制备出来，它们就用0.22微米过滤器进行无菌过滤，并在四摄氏度下储存。溶液的制备方式是，最终输注剂量分别接近每公斤和每分钟一毫克和两毫克。

在富含葡萄糖的条件下，在基础条件下测量葡萄糖外观速率时，分别以每公斤1.08毫克和分钟1.9毫克/公斤的速度注注6种氘代葡萄糖的起始平均恒定速率输注。为了模拟喂养状态，我们在富含葡萄糖的条件下采用平均D-葡萄糖输注速率为每公斤和每分钟18.8毫克。将小鼠从家笼中取出，并在实验开始前三小时将它们放入禁食笼中。

在这项实验中，我们使用了来自C57BL6J菌株的四个月大的雌性小鼠。通过将小鼠分组到每个胰岛素泵的设定数量的小鼠中来组装笼中设备。将隔板放在平坦，稳定的底座上，为小鼠制作单独的摊位。

笼子是透明的，由有机玻璃制成。有一个平坦，稳定的基地，隔板位于该基础上。笼子的门滑动关闭，底部有一个缺口，允许尾巴通过。

组装含有一毫升基底输液的注射器，然后使用聚乙烯管连接到输液泵管。通过将速率设置为每小时150微升（这是基本速率）来准备输液泵。将水浴加热至48摄氏度。

准备靠近水浴的导管插入站，其中包含30号半英寸针头，硅胶管和一英寸透明运输胶带。选择一个鼠标并将其放在可以进入尾部的安全支架中。在尾部的近端部分放置一块胶带，以便为更远端的导管插入留出空间。

将鼠标带到水浴槽中，将尾巴插入水浴中约30至45秒。这有助于扩张尾部脉管系统以进行导管放置。导管插入必须在无菌条件下进行。

一旦尾巴变暖，清洁尾巴，并在尾巴的近端放置一个小的铜无齿鳄鱼夹作为止血带。在放大镜下可视化侧尾静脉。然后，小心地将导管插入尾静脉，并轻轻冲洗溶液以确保导管的通畅性。

在插入部位周围缠绕一块运输胶带以固定导管，并从尾部取出小止血带。将鼠标放在单独的笼子中并关闭滑动门，确保尾巴突出穿过凹口并保持在笼子外面。在整个导管和尾部上再放一块胶带，将其固定在笼子的底板上。

断开冲洗与尾静脉导管的连接，并将小夹子放在导管的硅胶管上，以防止在连接泵的输液管路时回流。牢固连接后，取下夹具并冲洗由输液组成的注油溶液。确保溶液在管中是透明的，没有血迹。

一旦注输液管线正常工作，请从鼠标上取下盖子。将标准床上用品放在鼠标周围。用含有示踪剂的输液开始输注，并连续运行三个小时。

在输注期间，继续检查小鼠的健康状况以及输液管路。确保输液管已正确固定，并且线路连接点没有泄漏。第一次输注完成后，停止输注并在导管管管上放置一个夹子以防止回流。

轻轻地将小鼠从其围栏中取出而不干扰导管以收集血液。对于这个实验，小鼠使用四毫米的柳叶刀进行了脸颊静脉穿刺。将大约75微升的血液收集到您想要的小瓶中。

为了在制备质谱分析中使样品脱蛋白，将约15微升血液加入500微升丙酮中。剩余的血液可用于通过血糖仪和/或离心机检查血糖水平，以分离血浆以备将来的激素测定。通过断开管道与注射器的连接，从注射器泵中取出输液，并将其替换为含有示踪剂和葡萄糖的第二次输液。

使用富含葡萄糖的同位素葡萄糖输注重复先前的输注步骤。要达到稳定状态，请以每小时600微升的速度推注第二滴液，持续15分钟。记下每组笼子的开始时间。

将输注速率降低到每小时150微升，以完成三小时的总输注时间。如前所述重复血液采样。断开输液，在导管部位施加压力，直到出血停止，然后将小鼠送回家笼。

接下来，将样本发送到GCMS。使用五乙酸衍生物通过GCCMS计算葡萄糖峰下葡萄糖同位素的同位素富集。简而言之，该方法涉及葡萄糖的五乙酸衍生物的制备，然后在正化学电离模式下使用GCMS进行样品分析。

对质荷比（171~169）进行选择性离子监测，以确定葡萄糖同位素的M加2富集。所有动力学测量均在假设稳态条件下进行。使用已建立的同位素稀释方程计算M的总血浆葡萄糖出现率加上葡萄糖同位素和血浆的两次富集。

在稳态条件下，假设葡萄糖的出现速率等于葡萄糖的消失速率。内源性葡萄糖产生速率等于总血浆葡萄糖速率减去外源性葡萄糖。表一包括该研究的代表性结果。

所有单位均以毫克/千克和分钟表示。使用先前描述的同位素稀释方程，计算总血浆葡萄糖率。在对照组中，空腹状态下的平均葡萄糖率为19.98。

在富含葡萄糖的条件下，葡萄糖的出现率为25.8。空腹状态下的葡萄糖产生率为19.08，富葡萄糖状态下的葡萄糖产生率为8.56。葡萄糖代谢异常和体内平衡在 PCOS 中很常见。

在葡萄糖代谢异常的疾病中，葡萄糖产生的抑制调节受到损害，导致高血糖。在这项研究中，我们描述了一种直接的方法来同时测量多只小鼠的肝葡萄糖产生速率。该实验的关键组成部分是插入导管并定义葡萄糖同位素和天然葡萄糖的精确测量，以便充分执行GCMS。

该研究的优点是由于尾静脉导管插入以及使用易于获得的稳定葡萄糖示踪剂，以微创方式完成输注。该研究存在一些局限性，包括程序的技术需求和对可能的额外技能的需求。总体而言，我们描述了一种在PCOS小鼠模型中测量总肝葡萄糖产生速率的简单，准确的方法。

该技术可以作为涉及小鼠模型葡萄糖代谢的多项研究的基础。