माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस ऊतक के संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमेटिक पृथक्करण

तंत्रिका ऊतक की छोटी मात्रा को सफलतापूर्वक अलग करने से प्रयोगशालाओं को उपचार प्रभावकारिता, सेलुलर फ़ंक्शन, साथ ही रोग और कार्रवाई के उपचार तंत्र में संरचना-विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लैस किया जा सकता है। यह तंत्रिका पृथक्करण प्रोटोकॉल लगातार एक अत्यधिक व्यवहार्य और वास्तविक एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है। इसके अलावा, हम उन नमूनों को संसाधित कर सकते हैं जो केवल उन लोगों का एक अंश हैं जो वाणिज्यिक किट के लिए अभिप्रेत हैं।

उचित योजना और तैयारी इस तकनीक के लिए एक सफल परिणाम की कुंजी है। प्रोटोकॉल के साथ खुद को परिचित करने के लिए कई अभ्यास दौर चलाना फायदेमंद होगा। छह महीने की महिला C57BL / 6J माउस को बेहोश करने के बाद, पेट के निचले हिस्से को चुटकी लें और संदंश का उपयोग करके त्वचा को उठाएं।

फिर कैंची का उपयोग करके, फर और त्वचा के माध्यम से रिबकेज के नीचे तक काटें। रिबकेज के नीचे शुरू होने और प्रत्येक कंधे की ओर बढ़ने वाले दो विकर्ण चीरों को बनाएं। फिर दिल को उजागर करने के लिए डायाफ्राम और रिबकेज को ध्यान से उच्छेदन करें।

दिल के चारों ओर किसी भी संयोजी ऊतक को सावधानीपूर्वक हटाने के बाद, सही आलिंद को क्लिप करने के लिए कैंची का उपयोग करें। फिर सांस लेने के लिए isoflurane प्रवाह बंद कर दें। संदंश के साथ दिल को स्थिर रखना और तितली सुई के बेवेल के साथ ऊपर का सामना करना पड़ रहा है, सुई के स्तर और जानवर के समानांतर रखते हुए बाएं वेंट्रिकल को छेदना।

इसके बाद, सुई को जगह में पकड़कर, पंप को चालू करें और कम से कम 30 मिलीलीटर खारा या हेपरिन समाधान को तब तक परफ्यूज करें जब तक कि दिल को छोड़ने वाला तरल पदार्थ अपारदर्शी न हो जाए और जिगर और फेफड़े रंग में पीला न हो जाएं। परफ्यूजन के बाद, पंप को बंद कर दें, सुई को हटा दें, और माउस को विच्छेदन क्षेत्र में स्थानांतरित करें। विच्छेदन के बाद, सिर के पीछे से आंखों तक फर को काटें और खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को वापस छील लें।

इसके बाद, आंखों के बीच खोपड़ी को क्लिप करें और 10 और 2 बजे की स्थिति में खोपड़ी के पीछे दो कटौती करें। फिर आंखों के बीच मूल कटौती के लिए खोपड़ी की मिडसैगिटल लाइन के साथ एक लंबा कट बनाएं। अगला, संदंश का उपयोग करके, खोपड़ी के दो हिस्सों को किनारों तक छील लें।

फिर मस्तिष्क को हटाने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें और इसे ठंडे डीपीबीएस से भरे 60 मिलीमीटर ग्लास पेट्री डिश में रखें और बर्फ पर रखा जाए। एक स्केलपेल या रेजर का उपयोग करके, प्रत्येक गोलार्ध को अलग करें और घ्राण बल्ब और सेरिबैलम को हटा दें। फिर हिप्पोकैम्पस के उजागर होने तक मिडब्रेन को हटा दें।

इसके बाद, संदंश के साथ मस्तिष्क को सुरक्षित करें। फिर संदंश के दूसरे सेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे हिप्पोकैम्पस को प्रत्येक गोलार्ध से बाहर निकालना। दोनों हिप्पोकैम्पी को ठंडे DPBS युक्त एक लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।

संदंश का उपयोग करके, हिप्पोकैम्पी ऊतक के टुकड़ों को सी ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब में एंजाइम मिश्रण 2 के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। टोपी घुमाने और कसने के बाद जब तक यह क्लिक नहीं करता है, तब तक ट्यूब को एक पृथक्करण में रखें और उपयुक्त कार्यक्रम चलाएं। जबकि कार्यक्रम चल रहा है, बीएसए बफर के दो मिलीलीटर के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर रखे गए 70 माइक्रोन सेल छलनी को प्री-वेट करें।

पृथक्करण कार्यक्रम पूरा होने के बाद, विघटित ऊतक में बीएसए बफर के चार मिलीलीटर जोड़ें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर सेल छलनी के माध्यम से मिश्रण को फ़िल्टर करें। इसके बाद, सी ट्यूब में डीपीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। फिर ट्यूब को बंद करें, समाधान को धीरे से घुमाएं, और इसे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।

सेंट्रीफ्यूज फ़िल्टर सेल निलंबन, गोली परेशान किए बिना supernatant त्याग और गोली की दुकान. मलबे को हटाने के लिए, ठंड DPBS के 1, 550 माइक्रोलीटर के साथ गोली resuspend और एक लेबल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण। फिर ठंडे मलबे को हटाने के समाधान के 450 माइक्रोलीटर जोड़ें और पिपेट ऊपर और नीचे।

धीरे से ठंडे DPBS के एक मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन ओवरले, शंक्वाकार ट्यूब की दीवार के खिलाफ टिप रखते हुए. प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि कुल ओवरले दो मिलीलीटर न हो। इसके बाद, पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 3, 000 बार जी पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।

सबसे ऊपरी परत aspirate, तो सफेद मध्य परत aspirate करने के लिए आगे और पीछे पिपेट टिप स्वीप। सबसे नीचे की परत को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना मध्य परत निकालें। इसके बाद, मिश्रण करने के लिए दो मिलीलीटर ठंडे डीपीबीएस और पिपेट को ऊपर और नीचे जोड़ें।

फिर पूर्ण त्वरण और पूर्ण ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। centrifugation के बाद, supernatant को छोड़ दें और एक मिलीलीटर बीएसए बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। सेल गिनती के बाद, शेष सेल निलंबन centrifuge और पतला जीवित मृत दाग के 50 microliters में गोली resuspend.

फिर नमूने को एक लेबल प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें और अंधेरे में 8 से 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, BSA बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और centrifugation चरण को दोहराएं। फिर supernatant को छोड़ दें, ट्यूब में बफर की एक छोटी राशि को छोड़ दें।

प्राथमिक गेट ने आगे स्कैटर बनाम साइड स्कैटर प्लॉट्स में मलबे को बाहर रखा और मृत कोशिकाओं को बाद में बाहर रखा गया। दूसरे गेट ने माइलिन मूल प्रोटीन के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर रखा। और शेष कोशिकाओं में से, प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के घनत्व भूखंड बनाए गए थे।

प्रत्येक न्यूरोनल सेल आबादी की आवृत्ति की गणना तीसरे गेट से बाहर की गई थी। मैनुअल यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के साथ संसाधित नमूनों ने ब्याज की कोशिकाओं की काफी कम आबादी प्राप्त की, जबकि स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के साथ संसाधित ताजा और निश्चित दोनों नमूनों ने ब्याज की कोशिकाओं की कई गुना अधिक आबादी दिखाई। जबकि परफ्यूजन और मलबे को हटाने के कदम शुरू में चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं, एक चिकनी और स्थिर हाथ बनाए रखने से सफलता सुनिश्चित करने में मदद मिल सकती है।