Kombinerad mekanisk och enzymatisk dissociation av mushjärnans hippocampala vävnad

Att framgångsrikt dissociera små mängder neural vävnad kan utrusta laboratorier för att få strukturspecifik inblick i behandlingseffekt, cellulär funktion samt sjukdoms- och behandlingsmekanismer. Detta neurala dissociationsprotokoll ger konsekvent en mycket livskraftig och faktisk encellssuspension. Dessutom kan vi bearbeta prover som bara är en bråkdel av de som de kommersiella satserna är avsedda för.

Korrekt planering och förberedelse är nyckeln till ett framgångsrikt resultat för denna teknik. Att köra flera övningsrundor för att bekanta dig med protokollet skulle vara fördelaktigt. Efter att ha bedövat en sex månader gammal kvinnlig C57BL / 6J-mus, nypa underlivet och lyft huden med pincett.

Skär sedan genom pälsen och huden till botten av bröstkorgen med sax. Gör två diagonala snitt som börjar under bröstkorgen och rör sig mot varje axel. Resektera sedan försiktigt membranet och bröstkorgen för att exponera hjärtat.

Efter att du försiktigt har tagit bort bindväv runt hjärtat, använd sax för att klippa det högra atriumet. Stäng sedan av isofluranflödet till andningen. Håll hjärtat stadigt med pincett och med fjärilsnålens fasa uppåt, genomborra vänster kammare samtidigt som nålen hålls jämn och parallell med djuret.

Håll sedan nålen på plats, sätt på pumpen och perfusera minst 30 ml saltlösning eller heparinlösning tills vätskan som lämnar hjärtat är ogenomskinlig och levern och lungorna bleka i färg. Stäng av pumpen efter perfusion, ta bort nålen och överför musen till dissektionsområdet. Efter halshuggning, skär pälsen från baksidan av huvudet upp till ögonen och skala huden tillbaka för att exponera skallen.

Klipp sedan skallen mellan ögonen och gör två snitt på baksidan av skallen vid klockan 10 och 2. Gör sedan ett långt snitt längs skallens midsagittala linje till det ursprungliga snittet mellan ögonen. Skala sedan bort de två halvorna av skallen med hjälp av pincett till sidorna.

Använd sedan en spatel för att ta bort hjärnan och placera den i en 60 millimeter glas petriskål fylld med kall DPBS och hålls på is. Använd en skalpell eller rakhyvel, separera varje halvklot och ta bort luktlökarna och cerebellum. Ta sedan bort mitthjärnen tills hippocampus exponeras.

Säkra sedan hjärnan med pincett. Använd sedan en andra uppsättning pincett, reta försiktigt hippocampus ur varje halvklot. Överför båda hippocampi till ett märkt 1,5 ml rör som innehåller kall DPBS och placera röret på is.

Använd pincett, överför hippocampivävnadsbitarna till ett C-rör och tillsätt 30 mikroliter enzymblandning 2 i röret. Efter att ha vridit locket och dragit åt tills det klickar, placera röret i en dissociator och kör lämpligt program. Medan programmet körs, förvåta en 70 mikron cellsil placerad på ett 50 ml koniskt rör med två milliliter BSA-buffert.

När dissociationsprogrammet är klart, tillsätt fyra milliliter BSA-buffert till den dissocierade vävnaden och filtrera blandningen genom cellsilen på det 50 ml koniska röret. Tillsätt sedan 10 ml DPBS till C-röret. Stäng sedan röret, virvla lösningen försiktigt och filtrera den genom cellsilen på det 50 ml koniska röret.

Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen, kassera supernatanten utan att störa pelletsen och förvara pelletsen. För borttagning av skräp, återuppliva pelletsen med 1 550 mikroliter kall DPBS och överför suspensionen till ett märkt 50 ml koniskt rör. Tillsätt sedan 450 mikroliter kall skräpborttagningslösning och pipett upp och ner.

Lägg försiktigt över cellsuspensionen med en milliliter kall DPBS och håll spetsen mot det koniska rörets vägg. Upprepa proceduren tills det totala överlägget är två milliliter. Därefter centrifugera suspensionen vid 3000 gånger G i 10 minuter med full acceleration och full paus.

Aspirera det översta lagret och svep sedan pipettspetsen fram och tillbaka för att aspirera det vita mellanskiktet. Ta bort så mycket av mellanskiktet som möjligt utan att störa det nedersta lagret. Tillsätt sedan två milliliter kall DPBS och pipett upp och ner för att blanda.

Centrifugera sedan suspensionen vid 1000 gånger G i 10 minuter med full acceleration och full paus. Efter centrifugering, kassera supernatanten och återsuspendera pelletsen i en milliliter BSA-buffert. Efter cellräkning centrifugera den återstående cellsuspensionen och återsuspendera pelletsen i 50 mikroliter utspädd levande död fläck.

Överför sedan provet till ett märkt flödesrör och inkubera vid rumstemperatur i 8 till 10 minuter i mörkret. Efter inkubation, tillsätt 500 mikroliter BSA-buffert och upprepa centrifugeringssteget. Kassera sedan supernatanten och lämna en liten mängd buffert i röret.

Den primära porten uteslöt skräp i de främre spridnings- kontra sidospridningsdiagrammen och de döda cellerna uteslöts därefter. Den andra porten uteslöt celler som är positiva för myelinbasiskt protein. Och av de återstående cellerna skapades densitetsplottningar av celler som var positiva för varje fluorokrom.

Frekvensen för varje neuronal cellpopulation beräknades ut ur den tredje porten. Prover bearbetade med manuell mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning gav en väsentligt lägre population av celler av intresse, medan både färska och fasta prover bearbetade med automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning visade en flera gånger högre population av celler av intresse. Medan stegen för borttagning av perfusion och skräp kan vara utmanande initialt, kan upprätthållandet av en jämn och stadig hand hjälpa till att säkerställa framgång.