Cryo-sectie dissectie van de volwassen subependymale zone voor nauwkeurige en diepe kwantitatieve proteoomanalyse

Onze dissectiemethode maakt een nauwkeurige isolatie van de ventriculaire neurogene niche mogelijk en is daarom zeer geschikt voor het bestuderen van de moleculaire micro-omgeving van deze niche. Het belangrijkste voordeel van deze dissectiemethode is dat het nauwkeurig en efficiënt is en minimale weefselverstoring veroorzaakt, terwijl het nog steeds compatibel is met massaspectrometrie voor proteoomanalyse. In dit protocol extraheren we de neurogene niche van de ventrikel uit een muizenbrein, maar deze methode kan ook worden toegepast op andere soorten en in verschillende gezondheids- en ziektetoestanden.

De techniek kan enige training vereisen. vooral met de scalpelsneden bij het blootstellen en extraheren van de ventriculaire neurogene niche. Na het euthanaseren van een 8 tot 10 weken oude C57 zwarte /6 mannelijke muis, extraheer de hersenen door handmatige dissectie en plaats deze in een kweekschaal met ijskoud dissectiemedium.

Verwijder met behulp van een scalpel de reukbol door een rechte coronale snede te maken tussen de reukbol en de binnenste pool van de cortex. Verwijder vervolgens de voorste pool van de cortex door een coronale snede te maken, zodat de laterale ventrikels zichtbaar zijn in het coronale vlak. Open vervolgens met een schaar beide laterale ventrikels van bovenaf, te beginnen met het sagittale gedeelte van het corticale oppervlak tot het ventriculaire lumen.

Verleng deze snede op een C-vormige manier na de ventriculaire flexie. Verbind vervolgens de caudale uiteinden van de linker- en rechter sagittale incisie, met behulp van een extra coronale snede. Verwijder vervolgens de cortex en het corpus callosum dat de mediale ventriculaire wanden bedekt.

Als het weefsel is bevestigd aan de mediale ventriculaire wanden, maak dan extra sneden of til de cortex en het corpus callosum op met een schaar om het weefsel los te maken. Verwijder vervolgens met behulp van een tang de cortex en het corpus callosum dat de laterale ventrikels bedekt. Gebruik een tang, spreid voorzichtig de ventriculaire wanden en verwijder de plexus choroideus.

Plaats vervolgens de hersenen op een glazen dia en plaats de glijbaan bovenop droogijs om de hersenen te bevriezen met de ventriculaire wanden in de open configuratie. Zorg er voordat u doorsnede voordat u doorgaat, dat de hersenen zijn bevestigd aan de cryostaataanhechtingsplaat aan de achterste hersenen met een insluitmedium voor bevroren weefsels. Zorg er bovendien voor dat er geen inbeddingsmedium in contact komt met de voorhersenen, vooral bij de ventrikels.

Snijd vervolgens 50 tot 100 micrometer dikke coronale delen van de hersenen tot het einde van de laterale ventrikel en monteer de secties op de glazen dia’s. Plaats de glasglaasjes op droogijs onder een dissectiemicroscoop. Til de plakjes 15 tot 30 seconden van het droogijs om een korte, onvolledige ontdooiing te bereiken, waardoor de compacte myeline van het striatum waarneembaar wordt als dichte witte stippen.

Scheid vervolgens met behulp van een voorgekoeld scalpel de subependymale zone van het aangrenzende striatum en breng het als een heel stuk of in twee tot vier delen verdeeld over in een microcentrifugebuis met behulp van de stompe rand van het gekoelde scalpel. Doe vervolgens hetzelfde voor de mediale ventriculaire zone. Myeline-geassocieerde, glycoproteïne-positieve interne capsules van het striatum werden geïdentificeerd in de wholemount-monsters, maar zelden in de cryo-sectie-dissectiemonsters via immunohistochemie.

Striatale contaminatie in de wholemount-monsters werd bevestigd door verrijking van myeline-eiwitten in de subependymale zone, vergeleken met de somato-sensorische cortexmonsters. Daarentegen toonden vergelijkingen van deze myelinemarkereiwitten in de cryo-sectie-dissectiemonsters geen significante verschillen in de subependymale zone en somato-sensorische cortexmonsters. Bij het vergelijken van massaspectrometrieresultaten tussen cryo-sectie-dissectie en laservangstmicrodissectie, leverde laservangstmicrodissectie ongeveer de helft minder gekwantificeerde eiwitten op, hoewel de weefselverzamelingstijd ongeveer twee keer zo lang was.

Principe component analyse laat zien dat er een grotere variabiliteit is tussen monsters verzameld met laser capture microdissectie, afgebeeld als vierkanten, dan tussen degenen verzameld met cryo-sectie-dissectie, afgebeeld als cirkels. Een 2D-annotatieverrijkingstest tussen cryo-sectie-dissectie en laservangmicrodissectie voor de subependymale en mediale ependymale zones onthulde vergelijkbare verrijking in zowel methoden als regio’s voor eiwitten geassocieerd met de extracellulaire ruimte. Cryo-sectie-dissectie biedt een robuustere identificatie en kwantificering van neurogenese in subependymale zone-geassocieerde extracellulaire matrixeiwitten.

In het geval van tenascine-C vertoonde alleen cryo-sectie-dissectie verrijking in de subependymale zone in vergelijking met de mediale ependymale zone. Zorg ervoor dat de hersensecties op de dia’s niet volledig ontdooid raken. Over het algemeen is het goed om de stappen in de dissectieprocedure te oefenen voor een consistent resultaat.

De dissectiemethode kan ook worden gebruikt met andere eiwitanalysemethoden die gemakkelijk zeer lage overvloedige eiwitten kunnen detecteren, zoals groeifactoren en cytokines. Deze microdissectiemethode stelde ons in staat om een nieuwe neurogeneseregulator te identificeren, en we geloven dat het anderen in staat zal stellen om andere regulatoren van neurogenese in verschillende contexten te identificeren.