Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu

Diseksiyon yöntemimiz ventriküler nörojenik nişin hassas izolasyona izin veriyor ve bu nedenle bu nişin moleküler mikroçevroronmentini incelemek için çok uygundur. Bu diseksiyon yönteminin ana avantajı, hassas, verimli olması ve proteom analizi için kütle spektrometresi ile uyumluyken minimum doku pertürbasyonuna neden olmasıdır. Bu protokolde, ventrikülün nörojenik nişini bir fare beyninden çıkarıyoruz, ancak bu yöntem diğer türlere ve çeşitli sağlık ve hastalık durumlarına da uygulanabilir.

Teknik biraz eğitim gerektirebilir. özellikle ventrikül nörojenik nişini açığa çıkarırken neşter kesikleri ile. 8 ila 10 haftalık bir C57 siyah/6 erkek fareyi ötenazi yaptıktan sonra, beyni manuel diseksiyonla çıkarın ve buz gibi diseksiyon ortamı içeren bir kültür yemeğine yerleştirin.

Neşter kullanarak, koku alma ampulü ile korteksin iç kutbu arasında düz bir koronal kesim yaparak koku ampulünü çıkarın. Daha sonra, koronal bir kesim yaparak korteksin ön kutbundan çıkarın, yanal ventriküllerin koronal düzlemde görünür olmasını sağlayın. Daha sonra makas kullanarak, kortikal yüzeyden ventrikül lümenine kadar sagittal bölümden başlayarak her iki lateral ventrikülleri de yukarıdan açın.

Ventrikül fleksiyonunu takiben bu kesimi C şeklinde uzatın. Daha sonra, ek bir koronal kesim kullanarak sol ve sağ sagittal kesiğin kaudal uçlarını bağlayın. Daha sonra, medial ventrikül duvarlarını kaplayan korteks ve korpus callosum’u çıkarın.

Doku medial ventrikül duvarlarına bağlıysa, ek kesikler yapın veya dokuyu yerinden çıkarmak için korteks ve korpus callosum’u makasla kaldırın. Daha sonra, kümes uçlarını kullanarak, lateral ventrikülleri kaplayan korteksi ve korpus callosum’u çıkarın. Forseps kullanarak, ventrikül duvarlarını dikkatlice yayın ve koroid pleksusu çıkarın.

Daha sonra, beyni cam bir kaydırağın üzerine koyun ve açık konfigürasyondaki ventrikül duvarlarıyla beyni dondurmak için kaydırağı kuru buzun üzerine yerleştirin. Bölümlemeden önce, beynin donmuş dokular için gömme ortamı ile arka beyindeki kriyostat bağlanma plakasına bağlı olduğundan emin olun. Ayrıca, özellikle ventriküllerde, hiçbir gömme ortamının fore beyinle temas olmadığından emin olun.

Daha sonra, lateral ventrikülün sonuna kadar beynin 50 ila 100 mikrometre kalınlığında koronal bölümlerini kesin ve bölümleri cam slaytlara monte edin. Cam slaytları bir diseksiyon mikroskobu altında kuru buzun üzerine yerleştirin. Kısa, eksik bir çözülme elde etmek için dilimleri kuru buzdan 15 ila 30 saniye boyunca kaldırın, striatumun kompakt miyelinini yoğun beyaz noktalar olarak gözlemlenebilir hale getirir.

Daha sonra, önceden soğutulmuş bir neşter kullanarak, subependymal bölgeyi bitişik striatumdan ayırın ve bir bütün parça olarak aktarın veya soğutulmuş neşterin künt kenarını kullanarak bir mikrosantrifüj tüpüne iki ila dört parçaya bölünün. O zaman aynı şeyi medial ventrikül bölgesi için de yapın. Striatumun miyelin ilişkili, glikoprotein pozitif iç kapsülleri tümmount örneklerde, ancak nadiren immünohistokimya yoluyla kriyo-kesit diseksiyon örneklerinde tanımlanmıştır.

Tümmount örneklerindeki striatal kontaminasyon, alt bölgedeki miyelin proteinlerinin somato-duyusal korteks örneklerine kıyasla zenginleştirilmesiyle doğrulandı. Buna karşılık, kriyo-kesit-diseksiyon örneklerinde bu miyelin belirteç proteinlerinin karşılaştırmalarında subependymal bölge ve somato-duyusal korteks örneklerinde önemli bir fark olmadığı tespit edildi. Kriyo-kesit diseksiyonu ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu arasında kütle spektrometresi sonuçları karşılaştırıldığında, doku toplama süresi yaklaşık iki kat daha uzun olmasına rağmen, lazer yakalama mikrodiseksiyonu yaklaşık olarak iki kat daha fazla nicel protein verdi.

Prensip bileşen analizi, kareler olarak tasvir edilen lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile toplanan örnekler arasında, daire olarak tasvir edilen kriyo kesit-diseksiyon ile toplananlardan daha büyük değişkenlik olduğunu ortaya koymaktadır. Subependymal ve medial ependymal bölgeler için kriyo-kesit diseksiyonu ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu arasındaki 2D ek açıklama zenginleştirme testi, hücre dışı alanla ilişkili proteinler için hem yöntemlerde hem de bölgelerde benzer zenginleşmeyi ortaya koydu. Kriyo-kesit diseksiyonu, subependymal bölge ile ilişkili hücre dışı matris proteinlerinde nörogenezin daha sağlam bir tanımlanması ve nicelleştirilmesini sağlar.

Tenascin-C durumunda, subependymal bölgede medial ependymal bölgeye kıyasla sadece kriyo-kesit-diseksiyon zenginleştirme gösterdi. Slaytlardaki beyin bölümlerinin tamamen çözülmemesine dikkat edin. Genel olarak, tutarlı bir sonuç için diseksiyon prosedüründeki adımları uygulamak iyidir.

Diseksiyon yöntemi, büyüme faktörleri ve sitokinler gibi çok düşük bol proteinleri kolayca tespit debilen diğer protein analiz yöntemleriyle de kullanılabilir. Bu mikrodispeksiyon yöntemi, yeni bir nörogenez düzenleyicisini tanımlamamıza izin verdi ve başkalarının nörogenezin diğer düzenleyicilerini çeşitli bağlamlarda tanımlamasına izin vereceğine inanıyoruz.