क्रायो-अनुभाग सटीक और गहरी मात्रात्मक Proteome विश्लेषण के लिए वयस्क Subependymal क्षेत्र के विच्छेदन

हमारी विच्छेदन विधि वेंट्रिकुलर न्यूरोजेनिक आला के सटीक अलगाव की अनुमति देती है, और इसलिए इस आला के आणविक माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। इस विच्छेदन विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह सटीक, कुशल है, और न्यूनतम ऊतक गड़बड़ी का कारण बनता है, जबकि अभी भी प्रोटिओम विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संगत है। इस प्रोटोकॉल में, हम माउस मस्तिष्क से वेंट्रिकल के न्यूरोजेनिक आला को निकालते हैं, लेकिन इस विधि को अन्य प्रजातियों और स्वास्थ्य और बीमारी के विभिन्न राज्यों में भी लागू किया जा सकता है।

तकनीक को कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है। विशेष रूप से स्केलपेल कटौती के साथ जब उजागर और वेंट्रिकुलर न्यूरोजेनिक आला निकालने. एक 8-से-10-सप्ताह पुराने C57 काले / 6 पुरुष माउस को euthanizing के बाद, मैन्युअल विच्छेदन द्वारा मस्तिष्क को निकालें और इसे बर्फ-ठंडे विच्छेदन माध्यम वाले एक संस्कृति पकवान में रखें।

एक स्केलपेल का उपयोग करके, घ्राण बल्ब और कॉर्टेक्स के आंतरिक ध्रुव के बीच एक सीधा कोरोनल कट बनाकर घ्राण बल्ब को हटा दें। अगला, कोरोनल कट बनाकर कॉर्टेक्स के पूर्वकाल ध्रुव को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पार्श्व वेंट्रिकल कोरोनल विमान में दिखाई दे रहे हैं। फिर, कैंची का उपयोग करके, शीर्ष से दोनों पार्श्व वेंट्रिकल्स को खोलें, कॉर्टिकल सतह से वेंट्रिकुलर लुमेन तक सैगिटल सेक्शन से शुरू करें।

वेंट्रिकुलर फ्लेक्सियन के बाद सी-आकार के तरीके से इस कटौती को लंबा करें। इसके बाद, बाएं और दाएं सैगिटल चीरा के पुच्छल सिरों को कनेक्ट करें, एक अतिरिक्त कोरोनल कट को नियोजित करें। इसके बाद, कॉर्टेक्स और कॉर्पस कैलोसम को हटा दें जो औसत दर्जे के वेंट्रिकुलर दीवारों को कवर करते हैं।

यदि ऊतक औसत दर्जे का वेंट्रिकुलर दीवारों से जुड़ा हुआ है, तो अतिरिक्त कटौती करें या कॉर्टेक्स और कॉर्पस कैलोसम को कैंची के साथ उठाएं ताकि ऊतक को हटाया जा सके। फिर, संदंश का उपयोग करके, पार्श्व वेंट्रिकल्स को कवर करने वाले कॉर्टेक्स और कॉर्पस कैलोसम को हटा दें। संदंश का उपयोग करके, ध्यान से वेंट्रिकुलर दीवारों को फैलाएं और कोरॉइड प्लेक्सस को हटा दें।

फिर, मस्तिष्क को एक ग्लास स्लाइड पर रखें और खुले कॉन्फ़िगरेशन में वेंट्रिकुलर दीवारों के साथ मस्तिष्क को फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ के शीर्ष पर स्लाइड रखें। सेक्शनिंग से पहले, सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क जमे हुए ऊतकों के लिए एक एम्बेडिंग माध्यम के साथ हिंद मस्तिष्क में क्रायोस्टेट अनुलग्नक प्लेट से जुड़ा हुआ है। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि कोई एम्बेडिंग माध्यम सामने के मस्तिष्क के संपर्क में नहीं आता है, खासकर वेंट्रिकल में।

फिर, पार्श्व वेंट्रिकल के अंत तक मस्तिष्क के 50-से-100-माइक्रोमीटर-मोटे कोरोनल वर्गों को काटें, और ग्लास स्लाइड पर वर्गों को माउंट करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सूखी बर्फ पर कांच स्लाइड रखें। एक संक्षिप्त, अपूर्ण पिघलने को प्राप्त करने के लिए 15 से 30 सेकंड के लिए सूखी बर्फ से स्लाइस को उठाएं, जिससे स्ट्रिएटम के कॉम्पैक्ट माइलिन को घने सफेद डॉट्स के रूप में देखा जा सके।

फिर, एक पूर्व-ठंडा स्केलपेल का उपयोग करके, आसन्न स्ट्रिएटम से सबपेंडीमल ज़ोन को अलग करें, और इसे एक पूरे टुकड़े के रूप में स्थानांतरित करें या ठंडे स्केलपेल के कुंद किनारे का उपयोग करके एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में दो से चार भागों में विभाजित करें। फिर औसत दर्जे के वेंट्रिकुलर क्षेत्र के लिए भी ऐसा ही करें। माइलिन से जुड़े, ग्लाइकोप्रोटीन-स्ट्रिएटम के सकारात्मक आंतरिक कैप्सूल को होलमाउंट नमूनों में पहचाना गया था, लेकिन शायद ही कभी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन नमूनों में।

पूरेमाउंट नमूनों में स्ट्रिएटल संदूषण की पुष्टि सोमाटो-संवेदी कॉर्टेक्स नमूनों की तुलना में सबपेन्डिमल ज़ोन में माइलिन प्रोटीन के संवर्धन द्वारा की गई थी। इसके विपरीत, क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन नमूनों में इन माइलिन मार्कर प्रोटीन की तुलना ने उप-उपकला क्षेत्र और सोमाटो-संवेदी कॉर्टेक्स नमूनों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के बीच मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों की तुलना करते समय, लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन ने लगभग आधे से अधिक मात्रा वाले प्रोटीन प्राप्त किए, हालांकि ऊतक संग्रह का समय लगभग दो गुना लंबा था।

सिद्धांत घटक विश्लेषण से पता चलता है कि लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के साथ एकत्र किए गए नमूनों के बीच बड़ी परिवर्तनशीलता है, जिसे क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन के साथ एकत्र किए गए लोगों की तुलना में वर्गों के रूप में चित्रित किया गया है, जिन्हें हलकों के रूप में दर्शाया गया है। क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के बीच एक 2 डी एनोटेशन संवर्धन परीक्षण सबपेंडीमल और औसत दर्जे के एपेंडिमल ज़ोन के लिए एक्सट्रासेल्युलर स्पेस से जुड़े प्रोटीन के लिए दोनों तरीकों और क्षेत्रों में समान संवर्धन का पता चला। क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन एक अधिक मजबूत पहचान और न्यूरोजेनेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रदान करता है सबपेन्डिमल ज़ोन-संबद्ध एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन।

टेनासिन-सी के मामले में, केवल क्रायो-सेक्शन-विच्छेदन ने औसत दर्जे के एपेंडिमल ज़ोन की तुलना में सबपेंडीमल ज़ोन में संवर्धन प्रदर्शित किया। सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर मस्तिष्क अनुभाग पूरी तरह से पिघले हुए नहीं होते हैं। कुल मिलाकर, एक सुसंगत परिणाम के लिए विच्छेदन प्रक्रिया में चरणों का अभ्यास करना अच्छा है।

विच्छेदन विधि का उपयोग अन्य प्रोटीन विश्लेषण विधियों के साथ भी किया जा सकता है जो आसानी से बहुत कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगा सकते हैं, जैसे कि विकास कारक और साइटोकिन्स। इस माइक्रोडिसेक्शन विधि ने हमें एक नए न्यूरोजेनेसिस नियामक की पहचान करने की अनुमति दी, और हमारा मानना है कि यह दूसरों को विभिन्न संदर्भों में न्यूरोजेनेसिस के अन्य नियामकों की पहचान करने की अनुमति देगा।