Summary
Zuurstofverbruik (OCR) is een veel voorkomende proxy voor mitochondriale functie en kan worden gebruikt om verschillende ziektemodellen te bestuderen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen die fysiologisch relevanter is dan andere methoden.
Abstract
Mitochondriën spelen een belangrijke rol bij cellulaire ATP-productie, regulering van reactieve zuurstofsoorten en Ca2+ concentratiecontrole. Mitochondriale disfunctie is betrokken bij de pathogenese van meerdere neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer. Om de rol van mitochondriën in modellen van deze ziekten te bestuderen, kunnen we mitochondriale ademhaling meten via zuurstofverbruik (OCR) als een proxy voor mitochondriale functie. OCR is al met succes gemeten in celculturen, evenals geïsoleerde mitochondriën. Deze technieken zijn echter minder fysiologisch relevant dan het meten van OCR in acute hersensegmenten. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden de auteurs een nieuwe methode met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen. De techniek is geoptimaliseerd met een focus op het striatum, een hersengebied dat betrokken is bij PD en de ziekte van Huntington. De analysator voert een live celtest uit met behulp van een 24-well plaat, die de gelijktijdige kinetische meting van 24 monsters mogelijk maakt. De methode maakt gebruik van cirkelvormig geponste stukjes striatale hersenplakken als monsters. We tonen de effectiviteit van deze techniek aan door een lagere basale OCR te identificeren in striatale plakjes van een muismodel van PD. Deze methode zal van breed belang zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van PD en de ziekte van Huntington.
Introduction
Mitochondriale disfunctie is betrokken bij verschillende neurologische ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer 1,2,3. PD-modellen zoals PINK1 knockout (KO) muizen en ratten vertonen een verminderde mitochondriale functie 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondriën geïsoleerd uit het striatum (STR) of de hele hersenen van de oude PINK1 KO-muis vertonen defecten in complex I 7,10,12,13. Het direct meten van het zuurstofverbruik (OCR) is een van de meest voorkomende methoden om de mitochondriale functie te evalueren, aangezien OCR is gekoppeld aan ATP-productie, de belangrijkste functie van mitochondriën14. Daarom kan het meten van OCR in ziektemodellen of van patiënten afgeleide monsters / weefsel helpen onderzoeken hoe mitochondriale disfunctie tot ziekte leidt.
Momenteel zijn er verschillende manieren om mitochondriale OCR te meten, waaronder de Clark-elektrode en andere O2-elektroden, O2 fluorescerende kleurstof en de extracellulaire fluxanalysator 15,16,17,18,19. Als voordeel maken O2 elektrode-gebaseerde methoden het mogelijk om verschillende substraten eenvoudig toe te voegen. Ze zijn echter onvoldoende om meerdere monsters tegelijkertijd te meten. Vergeleken met traditionele O 2-elektrode-gebaseerde methoden biedt de extracellulaire fluxanalysator, een veelgebruikt hulpmiddel voor OCR in celculturen of gezuiverde mitochondriën, een verbeterdedoorvoersnelheid van 15,18,20. Niettemin worden al deze methoden meestal toegepast om OCR te meten in geïsoleerde mitochondriën of celculturen 6,16,17,19,20,21. De isolatie van mitochondriën veroorzaakt onbedoelde schade en geëxtraheerde mitochondriën of celculturen zijn minder fysiologisch relevant dan intacte hersenplakken22. Zelfs wanneer micro-elektroden in plakjes worden gebruikt, zijn ze minder gevoelig en moeilijker te bedienen dan in gekweekte cellen23.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een methode ontwikkeld met behulp van de XF24 extracellulaire fluxanalysator, die de analyse mogelijk maakt van meerdere metabole parameters van acute striatale hersenplakken van muizen24. Deze techniek zorgt voor continue directe kwantificering van mitochondriale ademhaling via de OCR. Kortom, kleine delen van striatale hersenplakken worden in putten van de eilandplaat geplaatst en de analysator gebruikt zuurstof- en protonfluorescente biosensoren om de OCR- en extracellulaire verzuringssnelheid te meten, respectievelijk 17,21,25.
Een van de unieke kenmerken van de analysator zijn de vier injectieputten, die de voortdurende meting van OCR mogelijk maken terwijl achtereenvolgens maximaal vier verbindingen of reagentia worden geïnjecteerd; dit maakt het mogelijk om verschillende cellulaire ademhalingsparameters te meten, zoals basale mitochondriale OCR, ATP-gebonden OCR en maximale mitochondriale OCR. De verbindingen die tijdens de metingen voor het hier getoonde protocol werden geïnjecteerd, waren werkconcentraties van 10 mM pyruvaat in de eerste oplossingsput (poort A), 20 μM oligomycine in de tweede oplossingsput (poort B), 10 μM carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazon (FCCP) in de derde put (poort C) en 20 μM antimycine A in de vierde put (poort D), gebaseerd op Fried et al.25. Opgemerkt moet worden dat deze concentraties werkconcentraties waren en dat voorraadoplossingen van respectievelijk 10x, 11x, 12x en 13x in de oplossingspoorten A tot en met D werden geïnjecteerd. Het doel van het gebruik van elke oplossing was als volgt: 1) Pyruvaat was noodzakelijk omdat, zonder dit, de toevoeging van FCCP een verminderde OCR-respons zou hebben veroorzaakt door een beperking van beschikbare substraten; 2) Oligomycine remt ATP-synthase en maakt de meting van ATP-gekoppelde ademhaling mogelijk; 3) FCCP ontkoppelt oxidatie van fosforylering en maakt het mogelijk om de maximale mitochondriale capaciteit te meten; 4) Antimycine A remt complex III in de elektronentransportketen en maakt daarom de meting van OCR mogelijk die niet aan de mitochondriën is gekoppeld.
De gebruikte concentratie oligomycine werd bepaald op basis van de volgende redenen: 1) De aanbevolen dosis oligomycine voor de meeste celtypen (geïsoleerde mitochondriën of celculturen) is 1,5 μM. Uit ervaring blijkt dat meestal 3x-10x van de dosis gedissocieerde cellen wordt gebruikt voor de plakexperimenten, omdat er een gradiënt kan zijn en de penetratie van oplossing in de plakjes tijd kost. Daarom moet de concentratie in het bereik van 5 μM tot 25 μM liggen. 2) Een 20 μM-concentratie werd geselecteerd op basis van Fried et al.25. Hogere concentraties werden niet geprobeerd vanwege de niet-specifieke toxiciteit van oligomycine. 3) In het rapport van Underwood et al.26 deden de auteurs een titratie-experiment voor oligomycine en ontdekten dat doses bij 6,25, 12,5, 25 en 50 μg / ml resulteerden in vergelijkbare remming. De hogere concentratie oligomycine (50 μg/ml) remde niet meer maar had een grotere variantie. 4) In onze waarneming lijkt de bepalende factor het penetrerende vermogen van oligomycine te zijn. Het is moeilijk voor oligomycine om het weefsel binnen te dringen, en daarom duurt het minstens 7 tot 8 cycli om het plateau te bereiken, de maximale respons. Zolang het het plateau bereikt, wordt aangenomen dat de remming maximaal is.
Een belangrijke technische uitdaging bij het aanpassen van de extracellulaire fluxanalysator voor het meten van OCR in striatale plakjes is het voorkomen van weefselhypoxie. Aangezien de buffer gedurende de gehele duur van de metingen (ongeveer 4 uur) niet van zuurstof was voorzien, was hypoxie een centraal probleem. Dit geldt vooral voor dikkere weefselmonsters, waar zuurstof niet door de monsters kan diffunderen. Om dit probleem op te lossen, werden plakjes gesneden op een dikte van 150 μm, zodat omgevingszuurstof het midden van de hersenplakken kon binnendringen. Bovendien werd 4 mg/ml runderserumalbumine (BSA) toegevoegd aan de buffer voorgeoxygeneerde kunstmatige hersenvocht (ACSF), wat de bepaling van maximale OCR vergemakkelijkte, zoals eerder gesuggereerd23. We onderzochten of cellen nog leefden. Eerst werden Hoechst 33258 (10 μM) en propidiumjodide (10 μM) gebruikt om te onderzoeken of cellen gezond waren onder deze omstandigheden. Vervolgens onderzochten we of medium stekelige neuronen functioneel gezond waren met behulp van patch-clamp-opname. We evalueerden verder of dopamine (DA) terminals in de striatale plakjes functioneel gezond waren door DA-afgifte te meten met behulp van snelle voltammetrie. De resultaten toonden aan dat striatale plakjes die niet van zuurstof waren voorzien (ACSF /BSA-groep) net zo gezond waren als de zuurstofrijke controlegroep24.
Vervolgens hebben we verschillende combinaties van plakdikte en ponsgrootte getest om optimale striatale plakcondities voor de fluxademhalingstest te bepalen. Dorsale striatale plakjes met verschillende diktes (150 μm en 200 μm) en ponsgroottes (1,0 mm, 1,5 mm en 2,0 mm in diameter) werden gebruikt voor OCR-analyse met behulp van de analysator. Striatale plakjes van 150 μm dik met een ponsgrootte van 1,5 mm in diameter hadden de hoogste koppelingsefficiëntie en OCR's binnen een optimaal bereik voor de analyzer24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures, inclusief dierwerk, werden uitgevoerd volgens nationale en internationale richtlijnen en werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Thomas Jefferson University. Mannelijke FVB/NTac muizen op de leeftijd van 3 tot 14 maanden werden gebruikt. De volgende stappen werden uitgevoerd in een niet-steriele omgeving, maar voorzichtigheid is geboden om alles zo schoon mogelijk te houden.
OPMERKING: De hier gepresenteerde methode werd vastgesteld en gebruikt in het onderzoek gerapporteerd door Zhi et al.24. De hier beschreven experimenten gebruikten een Seahorse XF24 extracellulaire fluxanalysator (zie Materiaaltabel). Deze methoden kunnen worden aangepast voor de XFe24-analyzer en sommige resultaten werden bevestigd met behulp van deze analyzer.
1. Hydraatpatroonsensoren (1 dag voor de test)
- Open de extracellulaire fluxtestkit (zie Materiaaltabel) en verwijder zowel de sensorcartridge (groen) als de gebruiksplaat (helder; Figuur 1A). Plaats de sensorcartridge opzij (sensoren omhoog) en raak de sensoren niet aan.
- Voeg 600 μL kalibrantoplossing (pH 7,4) toe aan elk putje van de gebruiksplaat. Plaats de sensorcartridge bovenop de gebruiksplaat en dompel de sensoren onder in de kalibrantoplossing. Zorg ervoor dat de driehoekige inkeping van het hulpprogramma en de sensorcartridgeplaat correct zijn uitgelijnd (figuur 1B).
- Sluit de extracellulaire fluxtestkit af met afdichtingsfolie om verdamping van de kalibrantoplossing te voorkomen en plaats deze vervolgens in een incubator van 37 °C die niet 's nachts is aangevuld met CO2 of zuurstof.
2. Bereid de weefselplaat voor (op de dag van de test)
- Open de eilandjesopvang microplaat en haal de eilandplaat eruit voor weefselzitting.
- Verwarm een geschikt volume (625 μL per put) voorgeoxygeneerde gemodificeerde kunstmatige hersenvocht (ACSF, samenstelling 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7,2) buffer tot 37 °C in een buis van 50 ml. Voeg vervolgens BSA toe aan een eindconcentratie van 4 mg /ml om de ademhalingsbuffer voor te bereiden. Over het algemeen is 50 ml voldoende voor één plaat.
- Voeg 625 μL ademhalingsbuffer (voorgeoxygeneerde ACSF-buffer met 25 mM glucose en 4 mg/ml BSA) voorzichtig toe aan elk putje van de eilandplaat en vermijd het schudden van de plaat. Zorg ervoor dat er geen restdruppels bovenop de sensorcartridge zitten en dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de buffer van elke put.
3. Acute striatale plakbereiding en weggesneden plakplaatsing
- Onthoofd de muis na cervicale dislocatie en ontleed de hersenen onmiddellijk in 10 ml ijskoude voorgeoxygeneerde snijoplossing (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glucose, pH 7,4).
- Sectie coronale striatale plakjes met een vibratoom volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) met een dikte van 150 μm in ijskoude, voorgeoxygeneerde snijoplossing.
- Herstel de plakjes in 50 ml zuurstofrijke ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glucose, 2 mM HEPES, pH 7,4) en houd in oplossing gedurende maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Breng na herstel de plakjes over naar een petrischaaltje van 35 mm x 10 mm met 5 ml ademhalingsbuffer.
- Gebruik een roestvrijstalen biopsiepunch (bijv. 1,5 mm diameter) om een cirkelvormig stuk weefsel te maken in het gewenste gebied van de gesneden hersenen. Houd het plakje in de buffer terwijl je zachtjes met de stoot naar beneden drukt. Zorg ervoor dat de pons hard genoeg naar beneden wordt geduwd om het weefsel te snijden. Verwijder de rest van het weefsel, til de pons weg en verwijder het cirkelvormige stukje weefsel in de buffer.
- Snijd het uiteinde van een pipetpunt van 1 ml om een gat te maken met een diameter van 1,5-2,0 mm en gebruik het om het geponste plak vast te houden en over te brengen naar de bovenkant van het opnamescherm. Zuig een stuk geponst hersenweefsel op en plaats het weefsel voorzichtig op de mesh-kant van het opnamescherm (figuur 2A). Het opnamescherm is een cirkelvormig stuk plastic met het gaas aan één kant bevestigd.
OPMERKING: De opnameschermen zijn opgenomen in het microplaatpakket (zie Materiaaltabel) en zijn vergelijkbaar met het pakket dat wordt gebruikt in Schuh et al.23. - Gebruik voorzichtig een papieren zakdoekje om het opnamescherm kort te drogen. Met het vocht verwijderd, wordt het weefsel plakkerig, waardoor het plakje zich aan het midden van het gaas kan hechten. Droog de plak niet te veel, want anders raakt deze beschadigd.
- Houd het plakje van het opnamescherm met een pincet naar beneden en plaats het in een van de putjes van de broedplaat (figuur 2B). Pas op dat je de plak niet laat vallen; zo ja, haal het scherm eruit en plaats er een nieuw segment op.
OPMERKING: Plaats geen hersensegmenten in de twee achtergrondcorrectieputten (A1 en D6) in de eilandplaat. - Incubeer de eilandplaat bij 37 °C in een incubator gedurende ten minste 30 minuten om temperatuur- en pH-evenwicht mogelijk te maken voordat de test wordt uitgevoerd.
4. Laden van cartridges met de gewenste verbindingen
- Verdun de gewenste verbindingen in gemodificeerde ACSF (37 °C) tot de uiteindelijke voorraadconcentratie van respectievelijk 10x, 11x, 12x en 13x van de werkconcentratie voor de poorten A tot en met D en pas aan pH 7,4. De test zal de verbindingen toedienen in volgorde van poort A tot D. Voor dit experiment werden de volgende oplossingen gebruikt, waarvan de respectieve werkconcentratie eerder is vermeld: 10 mM pyruvaat (poort A), 20 μM oligomycine (poort B), 10 μM of andere concentraties FCCP (poort C) en 20 μM antimycine A (poort D).
- Plaats 75 μL van de verdunde verbindingen voorzichtig voor in de juiste injectiepoorten van de sensorcartridge. Plaats de uiteinden halverwege in de injectiepoorten in een hoek van 45° met de punt tegen de wand van de injectiepoort. Tips mogen niet volledig op de bodem van de injectiepoorten worden ingebracht, omdat dit samengestelde lekkage door de poort kan veroorzaken.
- Trek de uiteinden voorzichtig uit de poorten om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Tik niet op een deel van de cartridge om luchtbellen te voorkomen.
- Inspecteer de injectiepoorten visueel voor gelijkmatig laden. Zorg ervoor dat alle vloeistof in de poort zit en dat er geen restdruppels bovenop de cartridge aanwezig zijn.
- Plaats de sensorcartridge op de gebruiksplaat en plaats deze gedurende 30 minuten in een incubator (niet-CO2) om deze weer tot 37 °C te laten opwarmen. Behandel voorzichtig door alleen de nutsplaat vast te houden. Beweeg zo min mogelijk.
5. Kalibratie en het uitvoeren van de test
- Laad de testsjabloon in de software. Druk op de groene START-knop .
- Zorg ervoor dat u het juiste protocol laadt. Het protocol bevat een combinatie van 3 minuten mix, 3 minuten wachten en 2 minuten meten sequenties (deze drie stappen vormen één meting). Wijzig de afstand van de sondekop van 26.600 naar 27.800 in de hardware-instellingen onder instrumentinstellingen25. Het is niet nodig om de sondekop voor de XFe24-analyzer te vervangen. Druk op START.
- Plaats de sensorcartridge op de gebruiksplaat in de instrumentenlade. De inkeping gaat in de voorste, linkerhoek. Zorg ervoor dat de plaat goed zit en plat is. Plaats de met geneesmiddelen gevulde sensorcartridge in de analysator voor kalibratie.
- Volg de instructies op het scherm om de sensoren te kalibreren en in evenwicht te brengen. Dit duurt ongeveer 30 minuten.
- Zodra de kalibratiestap is voltooid, verwijdert u de kalibratieplaat en vervangt u deze door de eilandplaat (met het gaas en de weefselplakken).
- Meet het zuurstofverbruik in elke put van de plaat met behulp van de testprotocollen. Het protocol bevat een combinatie van 3 minuten mix, 3 minuten wachten en 2 minuten metingssequenties (deze drie stappen vormen één meting), waarna de OCR wordt berekend.
- Neem voor het hele experiment 4x OCR-metingen op om een uitgangswaarde te creëren, gevolgd door de injectie van poort A (pyruvaat) met 4x-metingen, vervolgens de injectie van poort B (oligomycine) met 8x-metingen, vervolgens de injectie van poort C (FCCP) met 5x-metingen en ten slotte de injectie van poort D (antimycine A) met 6x-metingen.
OPMERKING: Dit aantal metingen na elke samengestelde injectie wordt bepaald afhankelijk van wanneer de meting het plateau bereikt. - Analyseer de OCR-meetgegevens en de koppelingsefficiëntiegegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste stap van deze studie was het optimaliseren van de plakdikte en ponsgrootte die wordt gebruikt om een deel van het striatum uit de plak te snijden (figuur 3A). Een plak met een dikte van 150 μm en een ponsgrootte van 1,5 mm gaven de beste resultaten, bepaald door de efficiëntie van de koppeling (figuur 3B-C). Zoals te zien is in figuur 3B, is OCR relatief stabiel gedurende 5 uur met minder dan 10% run down. Daarnaast werden functionele metingen gebruikt, evenals patch-clamp-opname van corticale neuronen en medium stekelige neuronen in het striatum, en fast-scan cyclische voltammetrie (FSCV) meting van DA-afgifte, om aan te tonen dat de neuronen en terminals volledig functioneel waren in deze voorbereiding, zoals getoond in Zhi et al.24. Inbegrepen bij dit, hebben we vervolgens verschillende concentraties FCCP getest om te ontdekken welke de beste respons zou geven; 10 μM FCCP gaf de beste uitlezing (figuur 3D1,D2) bepaald door de reserve ademhalingscapaciteit:
Reserve ademhalingscapaciteit = maximale ademhaling - basale ademhaling
Deze plakcondities werden gebruikt om de verschillen in de OCR van striatale plakjes van PINK1 KO-muizen en wild-type (WT) nestgenoten te meten. Voor de resultaten van PINK1 KO- en WT-muizen werden 3-4 muizen gebruikt en 4-6 replicaties per muis en gemiddeld om één gegevenspunt te verkrijgen. Aangezien PINK1 een belangrijke regulator van de mitochondriale functie is, werd verwacht dat mitochondriale disfunctie zou worden gevonden in de KO-muizen, gemeten door verminderde mitochondriale OCR. Inderdaad, een leeftijdsafhankelijke afname van OCR was duidelijk bij de KO-muizen in vergelijking met hun WT-controles (figuur 4A, D). Basale OCR was vergelijkbaar in zowel de KO- als de WT-groep voor jonge muizen (3-4 maanden); basale OCR daalde echter voor de KO-muizen in de oude groep (10-14 maanden; Figuur 4B,E). Koppelingsefficiëntie, als volgt bepaald;
Koppelingsefficiëntie = [ATP-productiesnelheid] / [basale ademhalingsfrequentie] × 100
echter afgenomen in de KO-muizen voor zowel de jonge als de oude groep (figuur 4C, F). Deze gegevens tonen aan dat de delen van striataal weefsel van PINK1 KO-muizen mitochondriale disfunctie hadden. Deze disfunctie bij de KO-muizen begon ook al op jonge leeftijd, aangegeven door de verminderde koppelingsefficiëntie, hoewel de basale OCR alleen in de oude groep afnam. Deze leeftijdsafhankelijke afname was waarschijnlijk een gevolg van accumulerende mitochondriale defecten veroorzaakt door de knock-out van PINK1.
Figuur 1: Afbeeldingen van de extracellulaire flux analyzer hydraatpatroon sensoren en plaat. (A) De sensorcartridge bovenop een kalibratieplaat (nutsplaat). (B) Zijaanzicht van de gebruiksplaat en sensorcartridgeplaat. De driehoekige inkeping van de plaat van het hulpprogramma en de sensorcartridge moet correct zijn uitgelijnd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geponste plakbevestiging en plaatsing. (A) Geponste plak wordt bevestigd aan de mesh-insert van het opnamescherm en vervolgens (B) voorzichtig in een van de putten van de broedende eilandplaat geplaatst om ervoor te zorgen dat het plakje niet loskomt of beweegt tijdens de meting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Optimale striatale plakconditie voor fluxademhalingstest. (A) Diagram van weefselponsgrootten (1,0 mm, 1,5 mm en 2,0 mm in diameter) voor het striatum (STR) met rode cirkels die de gebieden vertegenwoordigen die voor de analyse zijn verkregen. (B1) O 2-verbruikssnelheden (OCR's) voor verschillende diktes en ponsgroottes van plakjes in de controlegroep vertoonden een stabiele basale ademhaling over de hele meting (4 uur) en OCR was evenredig met het volume van de plak. OCR's werden gemeten in plakjes van 150 μm en 200 μm dikte gestanst door 1,0 mm, 1,5 mm en 2,0 mm pons. De gebruikte combinaties worden in de legenda's vermeld als dikte * ponsgrootte (bijv. 150 μm * 1 mm). (B2) Gemiddelde OCR's gemeten in plakjes met een dikte van 150 μm, geponst met een pons van 1,5 mm; n = 7. (C1) Representatieve OCR-responsen van plakjes met verschillende diktes en diameters met 10 mM pyruvaat (P), 20 μM oligomycine (O), 10 μM FCCP (F) en 20 μM antimycine A (A) sequentieel geïnjecteerd. De pijlen geven het tijdstip van injectie van deze verbindingen aan. (C2) De mitochondriale koppelingsefficiëntie werd vergeleken tussen verschillende groepen. Plakjes van 150 μm * 1,5 mm hadden het hoge koppelingsrendement maar de kleinste variantie; n = 4. (D1) Titratie-experiment voor FCCP werd uitgevoerd en 10 μM FCCP gaf de grootste reservecapaciteit; n = 4 voor elke groep. (D2) Titratie-experimenten voor FCCP werden uitgevoerd met een analysator en 10 μM FCCP gaf de grootste reservecapaciteit; n = 4 voor elke groep. De waarden in de cijfers zijn gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Dit cijfer is aangepast van Zhi et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: PINK1 KO-plakjes uit de oude groep met een significant lagere OCR. OCR's van acute STR-plakjes (150 μm * 1,5 mm) van muizen in de jonge (A, B en C) en de oude groepen (D, E en F), blootgesteld aan opeenvolgende toevoegingen van ademhalingsmodulatoren (getoond met behulp van pijlen). De OCR van de jonge groep verschilde niet significant tussen verschillende genotypen (B), terwijl de koppelingsefficiëntie (bepaald als een procentuele waarde met behulp van de hierboven genoemde formule %) was afgenomen in PINK1 KO-plakjes (C). In de oude groep vertoonden de PINK1 KOslices een significant verlaagd basaal ademhalingsniveau (E) en koppelingsefficiëntie (F). De volgende oplossing, 10 mM pyruvaat (P), 20 μM oligomycine (O), 10 μM FCCP (F) en 20 μM antimycine A (A), werd sequentieel geïnjecteerd. n = 4 voor elk genotype en elke leeftijd. De waarden in de cijfers zijn gemiddeld ± SEM. Het verschil werd als significant beschouwd wanneer p < 0,05 (*). Dit cijfer is gewijzigd van Zhi et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de door ons ontwikkelde methode kon een XF-analyzer worden gebruikt voor het meten van OCR in striatale plakjes van volwassen muizen over een tijdspanne van 4 uur. Deze methode biedt een nieuwe manier om cellulaire bio-energetica te meten in stoten die zijn weggesneden uit anatomisch gedefinieerde hersenstructuren. Omdat de weefselmonsters die worden geanalyseerd vrij klein zijn, kunnen de metabole parameters van specifieke hersengebieden die betrokken zijn bij een ziekte worden onderzocht. Bovendien bootst het gebruik van acute plakjes de fysiologische cellulaire omgeving beter na, wat niet kan worden bereikt met geïsoleerde mitochondriën of gekweekte cellen en organotypische plakjes. Verder verhoogt het meten van OCR in meerdere hersengebieden van een enkel dier of over meerdere dieren in één 24-well plaat de statistische kracht van studies die deze nieuwe techniek implementeren enorm.
Dit is het eerste protocol van OCR-meting in acute striatale plakjes van volwassen muizen. De focus lag op de STR, omdat het een van de hersengebieden is die voornamelijk betrokken zijn bij PD en de ziekte van Huntington. De basale OCR en koppelingsefficiëntie in onze studie zijn vergelijkbaar met de andere studies die OCR meten in acute hersensegmenten met behulp van de XF-analyzer 25,26,27. De reserve ademhalingscapaciteit van striatale plakjes in onze studie lijkt echter kleiner in vergelijking met de andere rapporten die andere hersengebieden hebben gemeten. Het is nog onbekend of dit verschil echte verschillen in reserve ademhalingscapaciteit tussen hersengebieden weerspiegelt of kleine verschillen in plakbereiding, weggesneden plakplaatsing of muizenspanning. Deze verschillen rechtvaardigen nader onderzoek.
Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol, waaronder het voorbereiden van acute hersensegmenten, het overbrengen van het geponste segment naar de bovenkant van het opnamescherm en het plaatsen van het segment in de put. De plakjes moeten tijdens de meting aan het opnamescherm worden bevestigd. Anders, als het plakje loskomt van het scherm en in de put van de plaat zit, zal het ver weg zijn van de zuurstofsensor, wat resulteert in een veel lagere uitlezing van de OCR en reacties op de medicijnen. We raden ten minste vier replicaties aan (vier weggesneden hersensegmenten in hetzelfde gebied) voor elke aandoening en exclusief de resultaten van de losgemaakte plakjes. OCR moet evenredig zijn met het weefselgehalte. Deze studie heeft de hoeveelheid weefsel niet gemeten, omdat de hersenen op dezelfde dikte werden gesneden en de plak werd geponst met dezelfde puncher. De hoeveelheid weefsel was dus constant en het was niet nodig om het weefselgehalte te bepalen. Het is van cruciaal belang om voor elke plaat (24 plakjes) een nieuwe ponsmachine te gebruiken om de scherpte en dus dezelfde hoeveelheid weefsel te garanderen. Bovendien duurt het snijden, het voorbereiden van weefselponsen en het bevestigen van de plakjes per muis ongeveer 30 minuten en duurt het in totaal ongeveer 2 uur voor twee paar muizen. De stabiliteit van acute hersenplakken is slechts goed voor 7-8 uur na sectie, zelfs onder optimale omstandigheden (beoordeeld met behulp van gevoelige functionele assays-patch-clamp-opname om de gezonde toestand van de neuronen te evalueren) en dus is het gebruik van een 96-putopstelling misschien niet praktisch.
Om het nut van de techniek te illustreren, hebben we de OCR gemeten van striatale plakjes van PINK1 KO-muizen en hun WT-nestgenoten. Een significante afname werd gevonden in de basale ademhaling van verouderde PINK1 KO-muizen in vergelijking met leeftijdsgematchte WT-controles, consistent met leeftijdsafhankelijke DA-afgiftetekorten24. Deze observatie komt ook overeen met eerder gepubliceerde studies, die de geldigheid van dit protocol bevestigen. Er zijn ook beperkingen aan de methoden. De OCR werd bijvoorbeeld gemeten uit de acute striatale hersenschijf, die waarschijnlijk onafhankelijk is van hersenactiviteit en meestal inactieve medium stekelige neuronen en dopaminerge terminals biedt, evenals astrocyten. Bovendien heeft de methode geen celtypespecifieke resolutie.
Samenvattend meet deze nieuwe methode OCR in acute hersenplakken van volwassen muizen en laat zien hoe PINK1, een PD-gerelateerd gen, de mitochondriale functie bij muizen beïnvloedt. Deze methode is eenvoudig te implementeren en breed toepasbaar op onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van PD en de ziekte van Huntington.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Wangchen Tsering en Pamela Walter voor hun kritische lezing en redactie van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 tot C.J. L. en NS098393 tot H.Z.) en de afdeling Neurowetenschappen aan de Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
