Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
דשים מהונדסים דורשים רשת כלי דם פונקציונלית משולבת. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לייצור דש רקמה מודפס בתלת-ממד המכיל רשת כלי דם היררכית ואת האנסטומוזות המיקרו-כירורגיות הישירות שלה לעורק עצם הירך של החולדה.
Transcript
הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים ליצור רשתות כלי דם היררכיות בתוך דש מהונדס ומושתל לחלוטין, מה שסלל את הדרך למחקרים חדשים על התנהגות כלי הדם תחת אינטגרציה in vivo. טכניקה זו שילבה את הרבגוניות של שתי טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד כדי ליצור ולהרכיב כלים על המיקרו והמזוקל שניתן לפענח ישירות באמצעות כלי שיט מארחים באמצעות מיקרו-כירורגיה. ניתן להשתמש בדשים וסקולריים מהונדסים במלואם לטיפול בפגמים גדולים ברקמות, כמו גם כדי לספק פלטפורמה לחקר התפתחויות ואינטגרציה של רקמות.
ניתן להרחיב את השיטות המוצעות כדי לחקור את שילובם של תאים ספציפיים לרקמות, כמו גם כדי להעריך את השימוש בחומרים ביולוגיים ותומכים שונים. התחילו במילוי תבנית BVOH ב-30 מיקרוליטרים של תמיסת הפולימר. צנטריפוגה התבנית ב 100 פעמים גרם במשך 2 דקות ולמלא את התבנית עם 20 מיקרוליטרים נוספים של תמיסת הפולימר כדי להבטיח מילוי מלא.
הקפיאו את התבניות המלאות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שכל תמיסת הפולימרים תקפא. הסר את הממס מן התבניות על ידי lyophilizing אותם לילה. כדי להסיר את חומר התבנית הקורבן, מעבירים את התבניות לאחר תהליך הייבוש בהקפאה לאמבטיית מים שעברה דה-יוניזציה של 5 ליטרים תחת ערבוב עדין.
החליפו את המים באמבטיה כשהם מתעננים. כאשר כל ה-BVOH מתמוסס, מייבשים את הפיגומים באוויר ומאחסנים אותם בתא ואקום עד לשימוש. מעבירים כ-4 מיליליטרים של חומר התמיכה המוכן והדחוס לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות באמצעות פיפטת תזוזה חיובית.
הקש על צלחת הבאר על משטח קשה כדי לאלץ את חומר התמיכה להתפשט באופן שווה בבאר. הכינו תרחיף המכיל 2 מיליון תאי גזע של HAMEC-ZsGreen ו-6 מיליון תאי גזע של עיסת דנטלית ב-10 מיליליטרים של מדיום תאי האנדותל. צנטריפוגה של תרחיף התא ב 200 פעמים g במשך 4 דקות כדי לקבל גלולת תא, ולאחר מכן לשאוף את התווך supernatant ולהחיות את גלולת התא ב 1 מיליליטר של rhCollMA bioink כדי לקבל bioink עם ריכוז תאים כולל של 8 מיליון תאים לכל 1 מיליליטר של bioink.
התאם מחט בקוטר פנימי של 0.22 מילימטר למחסנית הדפסה ענברית של 3 מיליליטר והנח את המחסנית בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. העבר 1 מיליליטר של תערובת התאים-ביואינק למחסנית ההדפסה על ידי מילויה מלמעלה באמצעות פיפטת תזוזה חיובית להפחתת בועות. התקן את מחסנית ההדפסה בכלי המתאים בביו-פרינטר.
שרטטו תבנית דו-ממדית של ריבוע 4 מילימטרים המכיל במרכזו תעלה מעגלית בקוטר 2 מילימטרים. הוציאו את הסקיצה ב-4 מילימטרים כדי לקבל קוביית 4 מילימטרים עם ערוץ מרכזי. ייצא אובייקט זה כקובץ STL.
ייבא תבנית STL של צלחת בעלת 12 בארות ללשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של bioprinter והנח אותה באזור המיועד של מיטת ההדפסה הווירטואלית. ייבא את קובץ STL של צורת הקובייה ללשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של bioprinter. לחץ על תיבת הסימון השתמש בחותך חיצוני ולאחר מכן קביעת התצורה של slicer תחת המקטע מאפיין האובייקט.
בחלון המוקפץ, בחר תבנית rectilinear עבור תבנית המילוי והקלד 30% בצפיפות המילוי, לחץ על קבל. לחץ על הקובייה והזיז אותה באמצעות העכבר כדי למקם עותק של צורת הקובייה בכל באר וירטואלית רצויה. לחץ על כפתור הוספת החומר בכרטיסיית החומרים של תוכנת חיתוך הביו-פרינטר כדי ליצור הגדרות חומר חדשות עבור ביואינק rhCollMA.
בחר את הגדרות החומר להדפסה. עבור לחץ, סוג 2 psi, ועבור סוג מהירות 20 מילימטרים לשנייה בתיבות המתאימות. הקצה את ערכי רוחב הקו וגובה הקו ל- 0.24 מילימטרים, ואת ערך התאוצה ל- 400 מילימטרים לשנייה מרובעת.
בכרטיסייה מידול מוצק, לחץ על אובייקט הקובייה ולאחר מכן לחץ על חומר rhCollMA ממקטע החומר כדי להקצות אותו לצורת הקובייה. בכרטיסייה bioassembly, לחץ על שלח עבודה הדפסה כפתור כדי לשלוח את משימת ההדפסה לפריפרינטר הביולוגי. טען את מחסנית ההדפסה העמוסה בביואינק התאי לתוך כלי ההפצה הפנאומטי של הסביבה 3 מיליליטר של הביופרינטר מבוסס ההבלטה התלת-ממדית.
לחץ על כפתור Cool תחת הכרטיסיה חימום בקרה או קירור במסך ממשק bioprinter כדי להגדיר את טמפרטורת מיטת ההדפסה ל-4 מעלות צלזיוס. טען את הצלחת עם אמבט התמיכה על מיטת המדפסת. בכרטיסיה הדפסה במסך ממשק bioprinter, לחץ על משימת ההדפסה ולאחר מכן לחץ על התחל, ואחריו GO כדי להתחיל את עבודת ההדפסה.
לאחר ההדפסה, חשוף את לוחית הבאר למקור אור של 405 ננומטר בעוצמה של 3 מילי-וואט לסנטימטר מרובע למשך 30 שניות כדי ליזום את הקישור ההצלבה של הביואינק rhCollMA. לאחר ההצלבה, דגירו את צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 דקות לפחות עד שכל אמבט התמיכה נמס. יש לשאוף בעדינות את אמבט התמיכה הנוזלי ולהחליפו אותו במדיום תאי האנדותל.
דגירה של המבנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. מיד לאחר הסרת חומר התמיכה של הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית, הניחו פיגום כלי דם מצופה PLLA:PLGA מצופה פיברונקטין ליד המבנה המודפס ביולוגית. הכנס את פיגום כלי הדם בערוץ הראשי של המבנה המודפס ביולוגית.
דגירה של המבנים המורכבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך יומיים. הכינו תרחיף תאי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי המבטא tdTomato בריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר. הניחו טיפה של 20 מיקרוליטר של תרחיף תא זה על משטח הידרופובי.
מניחים בעדינות את פיגומי כלי הדם על גבי הטיפות כך שהלומן של הפיגום בקצה אחד יוצר מגע עם טיפת התא. שאפו את הטיפה מהקצה הנגדי של הפיגום ומילאו את לומן שלה בתרחיף התא. מניחים את הפיגום היושב בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומכניסים אותו לסיבוב בתוך אינקובטור לח למשך 60 דקות.
לבסוף, מעבירים את הפיגום לצלחת של 12 בארות ומוסיפים 2 מיליליטרים של מדיום תאי האנדותל. מבט מהצד של דש מהונדס מייצג שצולם ארבעה ימים לאחר בטנת האנדותל של פיגום כלי הדם מוצג כאן. המיקרו-וסקולטורה המודפסת ביולוגית מוצגת בירוק, ואילו רירית האנדותל מוצגת באדום.
התמונה הייצוגית מציגה את האנסטומוזות בין כלי הדם המודפסים ביולוגית לבין רירית האנדותל. חיסון לאקטין השריר החלק, גרעינים ותאי אנדותל לאחר שבעה ימים של דגירה מוצג כאן. התמונה הייצוגית מציגה אנסטומוזות שהושלמו של הדש המהונדס עם עורק הירך של חולדה לפני הסרת המהדק ולאחר הסרת המהדק.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההבשלה והאינטגרציה של כלי דם מודפסים בתלת-ממד in vivo ולנטר את הזלוף של השתל באיבר האחורי כדי לבסס את הפוטנציאל והבטיחות לשימוש בו לטיפול בפגמים ברקמות.
Tags
ביו-הנדסה גיליון 183Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
