Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

This content is Free Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

Brug af In Vivo-billeddannelse til screening for morfogenesefænotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infektion i en pattedyrvært

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Journal (Immunology and Infection)

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Journal (Immunology and Infection)

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Click here for the English version

Brug af In Vivo-billeddannelse til screening for morfogenesefænotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infektion i en pattedyrvært

Article DOI: 10.3791/64258-v

October 12th, 2022 •

Rohan S. Wakade¹, Damian J. Krysan^1,2, Melanie Wellington¹

¹Department of Pediatrics, Carver College of Medicine, University of Iowa, ²Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 12th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Dette manuskript beskriver en metode til screening af moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefænotyper under aktiv infektion i en pattedyrsvært ved hjælp af ikke-invasiv konfokal mikroskopi.

Transcript

Candida albicans morfogenese udløses af et utal af miljøsignaler. Ved at studere morfogenese in vivo bestemmer vi, hvordan organismen integreres og reagerer på alle disse miljøsignaler. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver os mulighed for at studere morfogenese i fravær af bias eller artefakter, der kan introduceres ved hjælp af in vitro-modelsystemer.

Meget få mennesker har erfaring med intradermale injektioner. Jeg anbefaler kraftigt, at en ny til denne teknik kontakter deres dyreressourcedyrlæge for at få hjælp til at lære det. Rohan Wakade, en postdoktor fra vores laboratoriegruppe, demonstrerer proceduren.

Begynd med at forberede dyret til podning ved at fodre klorofylfri chow i mindst syv dage før podning. En dag før injektion skal du tage en dab af Canada albicans celler fra en koloni ved hjælp af en tandstikker. Pod 25 ml YPD og gentag denne proces flere gange for at opnå celler fra flere forskellige kolonier.

Inkuber kulturen natten over ved 30 grader Celsius i en orbital shaker-inkubator ved 175 o / min. Centrifuge en milliliter kultur i to minutter ved 500 x g, vask derefter gæren tre gange med en milliliter steril DPBS. Resuspender pelleten i en milliliter steril DPBS og fortynd kulturen ved 1 til 100.

Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og juster derfor celletætheden. Opret derefter podekulturen til injektion ved at blande lige store mængder af den refererede og eksperimentelle stamme. Brug en vatpind i bomuld til at anvende en over-the-counter hårfjerningscreme liberalt på den indre og ydre overflade af begge ører på et bedøvet dyr.

Efter to til tre minutter tørres øret forsigtigt med et tørt gasbind efterfulgt af gasbind mættet i sterilt vand for grundigt at fjerne hårfjerningscremerester. Efter sterilisering af ørens overflade med 70% ethanol blandes inokulumet godt ved at vende hætteglasset flere gange eller hvirvle det. Tegn 20 til 30 mikroliter inokulum i en insulinsprøjte.

Hold kanylen i opretstående stilling, og bank forsigtigt på sprøjten for at sikre, at der er luft i tønden øverst. Skub forsigtigt luft og overskydende podeglas tilbage i poderøret eller et affaldsrør, så stemplet er ved 10 mikroliter-mærket. Påfør over disken dobbeltsidet hudtape på et lille konisk eller rundbundet plastrør og drapér øret over båndet, så du undgår at løsne anæstesinæsekeglen.

Hold sprøjtenålen næsten parallel med huden og undgå store vener, indsæt spidsen af nålen i det yderste lag af huden, indtil skråen er lige dækket, og injicer langsomt podet intradermalt. En god intradermal injektion vil hæve en lille boble i huden. Hold nålen på plads i 15 til 20 sekunder, før du fjerner den fra øret for at minimere lækage.

I henhold til institutionelle protokoller skal du markere buret med biohazard-etiketter, der angiver, at dyr i buret er inficeret med Candida albicans. Ved hjælp af de samme vaskede kulturer, der blev brugt til at forberede podningen, skabes en 1 til 50 fortynding af celler i RPMI 1640, suppleret med 10% varme og aktiveret føtalt bovint serum og inkuberes ved 37 grader Celsius med tumbling i fire timer. Prøven undersøges ved hjælp af et mikroskop.

Tæl mindst 100 celler, og registrer antallet af gær- og trådceller for hver stamme. Drej det lange arbejdsdistancemål på plads, og læg en dråbe nedsænkningsvæske på linsen. Sænk objektivet for at undgå mulig skade, når dækslet placeres.

Plads nummer 1.5 dæksel glider over sceneåbningen og tape den på plads. Hæv målet, så nedsænkningsvæsken er i kontakt med både objektivlinsen og dækselslippen. Fastgør en anæstesi næsekegle på mikroskopstadiet på en sådan måde, at den dækker dyrets næse helt, når den er i position til billeddannelse.

Placer næsen på en bedøvet mus i næsekeglen. Placer en dråbe sterilt vand på dækselslippet over objektivlinsen. Juster anæstesinæsekeglen, og placer musen, så musens øre er over vanddråben.

Tag en anden dækselseddel, og placer dækslipens kant parallelt med musens krop med kanten, der rører musen, hvor øret møder hovedet. Brug en hængselbevægelse til at sænke den frie kant af dækslet glide til mikroskoptrinnet. Da dækselslippet kommer mod mikroskoptrinnet, vil det flade øret.

Tape topdækslet sikkert for at holde lige nok tryk til at holde øret fladt og undgå at fange musens hår eller knurhår i båndet. Medmindre der anvendes et mikroskop med et miljøkammer, skal du løse musens krop med en steril drapering for at opretholde et normalt termisk miljø. Ved hjælp af hvidt lys, widefield-billeddannelse, juster fokusplanet ind i ørevævet og fokuser på de røde blodlegemer, der bevæger sig i blodkarrene.

For at opnå et stærkt nok signal til støjforhold, så morfologi kan bestemmes for alle celler i synsfeltet, skal du justere lasereffekten eller billeddannelseshastigheden. For at undgå vævsskade skal du bruge den lavest mulige lasereffekt. Vælg et synsfelt med klar filamentdannelse i den refererede stamme, og hvor de fleste organismer er spredt nok ud til, at deres morfologi kan bestemmes.

Indstil de øverste og nederste fokusplaner for en Z-stak. Det er ikke nødvendigt at dække hele dybden af det inficerede område, men husk på, at organismer øverst eller nederst i det afbildede volumen typisk udelukkes fra analysen. Anskaf Z-stack-billeder, pseudofarve hver kanal for at skelne mellem hver stamme og overlejre kanalerne.

Gem billederne. Brug billedbehandlingssoftware til at udføre en maksimal projektion af Z-stakken til et todimensionelt billede. Tæl hver organisme set i de maksimale projektionsbilleder efter stammetype og morfologi.

Den refererede stamme danner hurtigt filamenter in vitro. Mens EFG1 Null ikke dannede filamenterne. EFG1 Null udviser også en betydelig filamentationsfejl in vivo.

Ca. 9% af EFG1 Null-celler voksede som filamenter in vivo. Tilsvarende viste CYR1 Null-mutantstammen en filamentationsdefekt in vitro sammenlignet med den refererede stamme. I modsætning hertil voksede 53% af CYR1 Null-mutantcellerne som filamenter in vivo.

Filamenterne dannet af CYR1 Null-mutanten var kortere end den refererede stamme. Det er vigtigt at holde nålen parallel med huden under podning. Målet er at placere podemuskulaturen lige under det ydre lag af huden.

Denne teknik kan også bruges med musestammer, der udtrykker et fluorescerende protein i værtsceller af interesse, så vi kan studere værtspatogeninteraktioner in vivo.

X

Simple Hit Counter