Journal
/
/
Laserinduserte virkningspotensiallignende målinger av kardiomyocytter på mikroelektrodearrayer for økt prediktivitet for sikkerhetsfarmakologi
JoVE Journal
Medicine
This content is Free Access.
JoVE Journal Medicine
Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

Laserinduserte virkningspotensiallignende målinger av kardiomyocytter på mikroelektrodearrayer for økt prediktivitet for sikkerhetsfarmakologi

1,862 Views

10:41 min

September 13, 2022

DOI:

10:41 min
September 13, 2022

2 Views

Transcript

Automatically generated

Denne metoden gjør det mulig å registrere intracellulære like handlingspotensialer på tradisjonell MEA, og dermed tillate en bedre beskrivelse av AP-formen og en mer sensitiv klassifisering av proarytmiske potensialer. Sammenlignet med typiske feltpotensialopptak gir den intracellulære faktiske potensielle formen mer innsikt i den nøyaktige autorisasjonen av de underliggende ionekanalene. Når den brukes på kardiomyocytter avledet fra kliniske pasienter gjennom stamcelleteknologi, kan metoden bidra til årsaksdiagnose og personalisering av C R P og hjertesykdommer som arytmier Vår tekniker, Karin Gebhardt, vil demonstrere kardiomyocytdyrking.

For å begynne å belegge elektrodefeltene til de tidligere autoklaverte MEA-ene, Dropwise med fibronektin ved hjelp av en 10 mikroliter pipette under den laminære strømningshetten. For å redusere det osmotiske sjokket, overfør pletteringsløsningen dråpevis i 90 sekunder inn i 50 milliliter røret som inneholder tinte kardiomyocytter. Tilsett forsiktig åtte milliliter pletteringsmedium i røret og bland cellesuspensjonen forsiktig.

Bruk en 10 milliliter pipette, fjern supernatanten, sørg for ikke å kaste pelleten og juster cellenummeret til endelig konsentrasjon. Før celleseter, fjern den påførte beleggløsningen fra MEA-elektrodeområdet ved hjelp av en 10 mikroliter pipette. For å unngå tørking av beleggfrøet cellene umiddelbart ved å legge fire mikroliter av cellene dråpevis på elektrodefeltene for begge, seks brønn MEA og en brønn M E A.Nå, la cellene feste seg til brønnene i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.

Under den laminære strømningshetten, tilsett 200 mikroliter og en milliliter sterilt platingmedium oppvarmet til 37 grader Celsius for henholdsvis seks Well MEA og single well MEA. For MEA-opptak, plasser MEA-systemet på toppen av enheten med MEA-brikkeholderen sentrert over målhullet. La deretter laseren fokusere på elektrodene ved å plassere MEA-oppsettet, slik at målet er direkte under hullet i MEA-systemet.

For å la cellene komme seg fra den mekaniske forstyrrelsen, overfør MEA-brikken med de dyrkede cellene fra inkubatoren til MEA-oppsettet 15 minutter før opptaket. Rengjør deretter kontaktputene og pinnene forsiktig, ved hjelp av en isopropanolpinne for å redusere støynivået. Plasser MEA forsiktig i MEA-oppsettet, og plasser MEA-brikken med serienummeret synlig på høyre side eller en enkelt brønn MEA-brikke med referanseelektroden til venstre.

Sett nå MEA-systemets integrerte oppvarming til 38 grader Celsius. Lukk lokket på enheten, da den integrerte sikkerhetsbryteren bare tillater at laseren aktiveres Hvis lokket er lukket over MEA-brikken. Ved hjelp av MEA-konfigurasjonsprogrammet settes MEA-systemfilteret med høyt pass og lavt pass til henholdsvis 0,1 hertz eller mindre og 3 500 hertz.

Bruk MC-rackprogramvaren eller annen alternativ programvare for opptak. Juster inndataområdet i henhold til eksperimentet. Sikre at signalet ikke metter forsterkeren og samplingsfrekvensen.

Bruk programvarens langsiktige visningsfunksjon for å sjekke opptaket. Etter å ha satt MEA-brikken inn i MEA-oppsettet, og satt opp programvaren, initialiserer lasermekanikken ved hjelp av FB ALP-programvaren. Klikk nå på initialiseringsknappen.

På slutten av initialiseringen vil det virtuelle laserpunktet være i brønn D for henholdsvis en seks brønn MEA og nederst til venstre for en enkelt brønn MEA. Bruk deretter kontrolltasten med et museklikk, flytt det virtuelle laserpunktet inn i midten av D fem-elektroden og juster fokuset ved å holde kontrolltasten og bla med musehjulet. Alternativt kan du bruke autofokusfunksjonen.

Trykk på knappen sett P en, og det virtuelle laserpunktet vil automatisk flytte inn i brønnen F.Systemet er nå justert. Juster lasereffekten og prosesstiden i henhold til eksperimentelle krav. For å aktivere laseren, klikk på laser av-knappen som vises som laser på, Bytt til opptaksprogramvaren.

Velg et filnavn og klikk på den røde opptaksknappen etterfulgt av avspillingsknappen øverst i vinduet for å registrere målingen. Før du åpner cellene med laseren, registrerer du en grunnlinje i 60 sekunder. Bytt tilbake til initialiseringsprogramvaren og deaktiver elektroder som skal utelukkes av laseren på det virtuelle kartet på høyre side av programvarevinduet.

For å starte laseren, bruk Alt-museklikk, og velg senterelektroden til denne brønnen. Dette initierer laseren for å åpne cellene på hver elektrode av denne brønnen automatisk, gjenta for hver brønn for å åpne alle tidligere aktiverte elektroder i denne valgte brønnen. Løs opp millimolær konsentrasjon av Nifedipin E-40 31, og Dofetilide i DMSO først, og deretter i komplett medium til 10 ganger ønsket konsentrasjon.

Overskrid aldri en endelig DMSO-konsentrasjon på 0,1 % i brønnen. Registrer grunnlinjeaktiviteten i 60 sekunder. Start den laserinduserte perasjonen som vist tidligere, noe som resulterer i en transformasjon av FPS til liAP-er.

Påfør alle stoffene som enkeltkonsentrasjon per brønn. Fjern 20 mikroliter og 100 mikroliter medium per brønn fra henholdsvis seks brønner og enkeltbrønner MEA. Tilsett 20 mikroliter eller 100 mikroliter av legemiddelbeholdningsløsningen som skal måles til brønnen.

Avhengig av MEA-type, og forsiktig pipette opp og ned to til tre ganger. La forbindelsene vaske inn i 300 sekunder. I løpet av denne tiden kan liAP-formen forvandle seg til FP-formen.

Igjen, indusert laser indusert perasjon og registrere mulige sammensatte induserte defekter på liAP i ytterligere 60 sekunder. Tilsetningen av nifedipin reduserte platåfasen av liAP-ene på en konsentrasjonsavhengig måte, og forkortet dermed hele liAP. Denne forkortelsen var sammenlignbar med feltpotensialene til kardiomyocytter fra umanipulerte elektroder.

E-40 31 hemmet repolariseringen av relevante KV ett punkt 11 kaliumkanaler og førte til arytmisk oppførsel av kardiomyocytter ved økte konsentrasjoner. E-40 31 økte også liAP-varigheten på en konsentrasjonsavhengig måte. På slutten av liAP ble det observert små positive spenningsavbøyninger ved 0,1 mikromolar som ble mer fremtredende med høyere konsentrasjoner, noe som indikerer en forbigående ny depolarisering kalt EAD.

Ved den høyeste konsentrasjonen på 0,1 mikromolar eskalerte disse EAD-ene over tid til ektopiske beats. Som er for tidlige handlingspotensialer. EAD og ektopiske beats er nøkkelindikatorer for proarytmisk aktivitet.

Og til slutt resulterer den elektriske aktiviteten i arytmisk juling. Konsentrasjonsresponsrelasjonene korrelerte med FPs og liAP-opptak. Videre, i nærvær av dofetilid, viste både FP og liAP varigheter på omtrent to sekunder i samme brønn, FP-bølgeformen presenterte regelmessige repolariseringsavbøyninger.

Mens i liAP EAD’s er detekterbare. Det er viktig å justere fokuset før hvert melomen, da et ufokusert mikroskopbilde kan påvirke åpningen av cellene. Tiltakspotensialet iverksettes også kort tid etter at opterperasjon skal brukes til analyse.

Denne teknikken er mer følsom når det gjelder å oppdage tidligere arytmiske effekter sammenlignet med standard MEA, noe som muliggjør mer presis påvisning av uønskede sammensatte effekter.

Summary

Automatically generated

Kombinasjonen av laserporering og mikroelektrodearrayer (MEA) tillater handlingspotensiallignende opptak av dyrkede primære og stamcelleavledede kardiomyocytter. Bølgeformformen gir overlegen innsikt i testforbindelsenes virkemåte enn standardopptak. Den kobler patch-clamp og MEA-avlesning for å optimalisere kardiosikkerhetsforskningen ytterligere i fremtiden.

Read Article