Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Мы опишем, как измерить возле мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в культуре астроцитов использованием полного внутреннего отражения и epifluorescence микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes. J. Vis. Exp. (26), e1142, doi:10.3791/1142 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мозг содержит глиальные клетки. Астроциты, типа глиальных клеток, уже давно известно, обеспечивают пассивную вспомогательную роль для нейронов. Тем не менее, все больше данных о том, что астроциты также могут активно участвовать в функции мозга с помощью функциональной взаимодействия с нейронами. Однако, многие фундаментальные аспекты астроцитов биологии остаются спорными, неясными и / или экспериментально неизученными. Одним из важных вопросов является динамика внутриклеточного кальция в переходных астроцитов. Это важно, поскольку кальций хорошо известна как важный вторичный мессенджер и потому, что было предложено, что астроциты высотах кальция может вызвать выпуск передатчиков из астроцитов. Тем не менее, не было никакой детальной или удовлетворения описание около кальция плазматической мембраны сигнализации в астроциты. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным инструментом для анализа физиологически соответствующих сигнальных событий в течение приблизительно 100 нм плазматической мембраны живых клеток. Здесь мы используем TIRF микроскопии и описывают, как монитор вблизи плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее уточнение и систематическое применение этого подхода есть потенциал, чтобы сообщить о точных деталях астроцитов сигнализации кальция. Детальное понимание астроцитов динамики кальция могут служить основой для понимания, если, как, когда и почему астроцитов и нейронов проходят кальций-зависимых функциональных взаимодействий.

Protocol

Экспериментальных процедур

Экспериментальная процедура состоит из двух основных частей, описанных в шаге мудрым образом ниже.

Часть 1: ПОДГОТОВКА ГИППОКАМПА астроцитов КУЛЬТУР

Короче говоря, смешанные гиппокампа астроцитов-нейрона культуры были подготовлены с использованием хорошо установленным протоколом 1,2,3. Мы оптимизировали процедуру для получения здорового культурного астроцитов. Все процедуры, перечисленные ниже, должны осуществляться в стерильных условиях, таких как капот ламинарного потока.

Подготовка покровных

  • 22 мм покровные (VWR, 48380-068)
  • Поли-D-лизин (PDL, Sigma P0899), аликвоты (1 мг / мл)
  • Ламинин аликвоты (20 мкг / мл): добавить 49 мл стерильной воды до 1 мг / мл ламинин решение (Sigma L2020), убедитесь, 1,2 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C
  1. Растворите PDL в стерильной воде (50 мкг / мл)
  2. Автоклав покровные, промыть стерильной водой и поместите в PDL (20 мл на 100 покровные). Оставить при комнатной температуре в течение ночи.
  3. Замените PDL стерильной водой (3 обширные моет). Затем сухие покровные и хранить при температуре 4 ° C.
  4. Накануне покрытие астроциты, место отдельных покровных в стерильных также на 6-луночного планшета (многоямного плоским дном пластины с крышками, стерильные с BD Bioscience). Положите 400 мкл ламинин на каждом покровное и инкубировать в течение ночи, в инкубаторе, чтобы избежать испарения.

Рассечение

Препарирование СМИ:

  • Сбалансированный 500 мл Эрла раствор соли (EBSS) (1X), жидкие (Invitrogen, 14155-063)
  • 5 мл HEPES решение (Sigma, H0887)

Гиппокампа СМИ:

  • 412,5 мл минимально необходимого среднего (MEM) (1X), жидкость содержит солей Эрла, но не L-глютамин или фенол красный (Invitrogen, 51200-038)
  • 10 мл глюкозы (Sigma, D-(+)-ГЛЮКОЗЫ БЕЗВОДНЫЙ SIGMA ULTRA G7528) 1 M в MEM
  • 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
  • 5 мл Натрия пируват решение (Sigma, S8636)
  • 12,5 мл HEPES раствор 1 М (Sigma, H0887)
  • 5 мл N-2 Дополнение (100X), жидкие (Invitrogen, 17502-048)
  • 50 мл лошадиной сыворотки, тепло-инактивированная (Invitrogen, 26050-088)

Папаин решение:

  • Добавьте 5 мл вскрытия средств массовой информации в Уортингтон папаин-022 флакона (LK003178; конечная концентрация 20 ЕД / мл) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин.

  1. Обезглавьте крысят в возрасте P1 (обычно 2 щенка) следующие рекомендации проверены и одобрены национальными правилами и ваши местные институциональные уходу и использованию животных комитета.
  2. Удалить кожу и череп и мозг место в чашке Петри заполнены холодной СМИ рассечение.
  3. Удалены мозговых оболочек, рассекать обоих полушарий и рассекать гиппокампе.
  4. Чоп в гиппокампе ~ 1X1 мм кусочки и переварить в растворе папаина при 37 ° С в течение 11-13 мин.
  5. Как только кусочки ткани осели, удалить папаин осторожно и добавляют 5 мл гиппокампа среду, чтобы удалить все следы фермента. Повторите этот шаг и ресуспендируют в гиппокампе среде (2 мл).
  6. Измельченного в порошок клетки ~ 5 раз, пока Есть не сгустки слева, с тремя пламени полированный пипеток все меньшие отверстия (1000 мкм, ~ 500 мкм и ~ 300 мкм).
  7. После растирают, проходят клетки через ячейки сетчатого фильтра (размер пор, 70 мкм, BD Bioscience). Граф клеток в 10 мкл суспензии. Регулировка громкости гиппокампа средой, чтобы иметь 400 000 клеток / мл.
  8. Аспирируйте ламинин от покровных, а до крышки можно сухих, пластина 200 мкл суспензии клеток в покровное.
  9. Оставьте их приложить в течение 60 мин в инкубаторе, а затем добавить 2 мл гиппокампа среды на лунку.
  10. На следующий день, аспирации старые гиппокампа средой для удаления мертвых клеток и мусора и добавьте 2 мл подогретого свежего гиппокампа среды.

Обслуживание

Neurobasal СМИ:

  • 500 мл neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
  • 10 мл сыворотки B27 бесплатное приложение (Invitrogen, 17504-044)
  • 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
  • 1,25 мл L-глутамина (Invitrogen, 25030-149)

Поток астроцитов-нейрон культур два раза в неделю с neurobasal среды, начиная через четыре дня после металлизации. Preincubate СМИ около 30 минут в инкубаторе в вентилируемом колбу, чтобы уравновесить температуру и CO 2.

Часть 2: КАЛЬЦИЯ IMAGING

Гиппокампа буфера записи: 110 мМ NaCl, 5,4 мМKCl, 1,8 мМ CaCl 2, 0,8 мМ MgCl 2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES (Все химические вещества из Sigma), рН 7,4 (регулируется с NaOH).

Загрузка красителя кальция индикатор в астроциты

  1. Место культуры в хорошо на 6-луночный планшет заполнен 2 мл гиппокампа буфера записи, содержащей 2,5 мкМ Fluo-4, А. М. (Invitrogen, F-14217) и 0,05% Pluronic ® F-127 20% раствор в ДМСО (Invitrogen, P-3000MP) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-30 мин.
  2. Удалить Fluo-4 решения и мыть покровные 3 раза гиппокампа буфера записи и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Место покровное на камеру, а чистая другой стороне покровного с объективом жидкости очистки.
  4. Положите одну каплю иммерсионного масла (погружение нефти типа DF с Cargille) на цель и поставить камеры (с открытой камерой на 25 мм выстрел покровное от Warner Instruments) на столик микроскопа (Olympus IX71).
  5. Посмотрите на клетки, используя пропускание света, чтобы увидеть, как выглядят клетки, и получить их в фокусе. Затем освещения клеток с 488 нм от монохроматора (полихромные V от до Vision) и определить, если сигнал флуоресценции от Fluo-4 является однородным и обнаруживается в астроциты.
  6. Используйте РПИ и TIRF освещения для измерения кальция в астроциты.

TIRF микроскопии

Одним словом, мы используем Olympus IX71 Микроскоп оснащен камерой Andor IXON DV887DCS EMCCD. Контроль возбуждения и захвата изображений достигается с помощью TILLVision программного обеспечения. Пучки 454/488/515 нм аргон (100 мВт) и 442 нм твердом состоянии (45 мВт) лазеры и управляться с ДО Polyline лазерной комбайнера, TIRF двойной конденсатор порт и acoustoptical настраиваемый фильтр и контроллер (AOTF, все из ДО Photonics) и подается в Kineflex широкие волокна полосы для вступления в конденсаторе TIRF. Мы используем Olympus 60X 1,45 NA линз для достижения TIRF. Усиление камеры настраивается для каждого астроцитов, чтобы обеспечить лучший сигнал-шум изображения. Фон и принципы микроскопии TIRF были недавно рассмотрели 4, 5. Большинство оптических компонентов мы используем были приобретены у ДО Photonics, которая сейчас является частью компании Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). Глубина проникновения МДП может быть рассчитана по уравнениям ниже.

Уравнение

D = глубина проникновения

n1 = преломления стекла

n2 = преломления клеточных

= угол падения

NAi = числовой апертурой падения


В целях обеспечения лазерной выравнивается оптимально для TIRF мы находим его полезным для наблюдения 100 нм флуоресцентного шарик (Invitrogen, F8803). Мы представляем отдельные кадры и видео из бисера с РПИ и TIRF микроскопии. Когда в TIRF, наблюдается резкое увеличение сигнал-шум и бисером дисплей броуновской диффузии. Мы находим его полезным для наблюдения за поведением 100 нм бисер с TIRF микроскопии на регулярной основе (~ раз в неделю), чтобы убедиться, что оптимальное TIRF происходит, а не угрозу косом освещении, что может произойти, если критический угол не были равны α (см. рис 1).

Применение G-белком рецептор агонистов связаны

Астроциты выражать различные Gq-связанных рецепторов, 6, 7, включая метаботропных рецепторы глутамата и P2Y рецепторов (агонист, АТФ, АДФ). Активация этих рецепторов приводит к значительному увеличению внутриклеточного уровня кальция в астроциты. Например, нетрудно заметить внутриклеточного кальция высотах во время применения СПС (30 мкМ) на астроциты 8-10. Мы используем быстрое решение переключатель с Warner инструменты называют VC-77SP Быстро Шаг перфузии системы (http://www.warneronline.com/index.cfm). С помощью этого метода решения могут быть применены в менее ~ 10 мс.

Рисунок 1





Рисунок 1. Мультфильм и фотографии изображений создана. А. Показывает фотографию Микроскоп установлен на airtable, в то время (B) показывает фотографию лазерной установки, контроллеры и балки коробки. С. Показывает фотографию столике микроскопа с камеры установлены для работы с изображениями. На левом быстро устройство перфузии можно увидеть (наряду с шаговым двигателем и тета трубки). На правом headstage из усилителя Axopatch 200A не наблюдается. Мультфильм схематизирует пути света в настройке и как TМДФ достигается. Лазерной сосредоточено на задней фокальной плоскости 60X 1,45 NA объектива и его положение регулируется от центра так, что он возникает в иммерсионного масла в критический угол α. В этот момент луч испытывает полное внутреннее отражение и убывает с расстоянием λ (см. уравнение в основной текст) в среду меньшим показателем преломления. В данном случае это буфер записи окружающие астроциты и астроциты себя. В результате оптического возбуждения (и, следовательно, изображения) молекул с точностью до ~ 100 нм от плазматической мембраны. В мультфильме ячейки это показано в виде зеленых "возбужденным" мембранных рецепторов, тогда как в клетке или на верхней поверхности клетки не возбуждаются. Полный отчет о микроскопии TIRF была предоставлена ​​Steyer и Алмерс 4.

Рисунок 2

Рисунок 2. Изображения 100 нм люминесцентные бусины, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. показывает EPI изображения поля зрения с несколькими десятками 100 нм флуоресцентные бусы. Красная точка стрелки бусы, которые поселились на стекло покровное, тогда как синие стрелки указывают на бусы, которые диффундируют в воде. Б. Шоу TIRF изображение одного и того же поля зрения, как показано на А. С этой точки зрения только приверженец бисером показаны красными стрелками видны. Это потому, что эти поселились на стекло coverlsip и, таким образом в течение ~ 100 нм затухающего поля. Бисер показано в по синим стрелкам, не в этом регионе и, таким образом, невидимые на изображениях TIRF. Ниже графики показывают 3D-рендеринга образов. Очевидно, что значительное увеличение отношения сигнал-шум происходит для бисера в затухающего поля при наблюдении с помощью микроскопии TIRF. На самом деле за этими изображениями сигнал-шум для РПИ составила 7,1 ± 0,6, тогда как для TIRF было 20 ± 0,7.

Рисунок 3

Рисунок 3. Изображения астроциты загружены Fluo-4 кальция индикатор красителя, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. EPI изображения поля зрения с пятью астроцитов. Б. изображение TIRF одного и того же поля зрения показано на В. Отметим, что образы в А и В существенно различаются. Это потому что с TIRF освещения только плазматической мембраны регионах в тесном прикладывание к покровное стекло в образ будут включены. Нижней панели показывают АТФ-вызвали внутриклеточного кальция переходных полученную с РПИ и TIRF микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хорошо установлено, что астроциты дисплей внутриклеточного кальция высот. Это происходит спонтанно, может быть вызвана активность нейронов или с применением агонистов для активации рецепторов на поверхности астроцитов 11. Одним из важных и спорный вопрос, является ли астроцитов внутриклеточного кальция высоты может вызвать высвобождение сигнальных молекул, которые активируют рецепторы нейронов на 11, 12. Это спорный, потому что было доказательств за и против этой точки зрения, как это подчеркивается в обзорах Хейдон 7, 13 и Маккарти 11 лабораторий. Исходя из наших последних изображений срез мозга и электрофизиологических данных, мы утверждали, что лучше и точное понимание динамики астроцитов кальция необходимо прежде, чем новые на базе гипотезы эксперименты могут быть разработаны для определения того, как нейроны, астроциты воздействия 14. В этом видео статье мы представляем простой способ изображения вблизи плазматической мембраны и глобальные изменения внутриклеточного кальция почти одновременно в культуре астроцитов. Неизбежные технические требования микроскопии TIRF в том, что культивируемые клетки должны быть использованы, поскольку они придерживаются стекло покровное в затухающих глубины поля 3. Стоит отметить, что астроциты в культуре изменить свои профили экспрессии генов по сравнению с теми в естественных условиях 15, и поэтому этот нюанс следует учитывать при реализации этого метода. При этом рассмотрение в виду, однако простой метод мы доклад не позволяют изображения и количественно около плазматической мембраны и глобальные изменения внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее применение подхода к астроциты обещает предоставление точных данных о внутриклеточные изменения кальция вблизи плазменной оболочки астроцитов. Наличие таких количественных данных будет полезна для полного понимания астроцитов биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Уэхара Мемориальный фонд Японии (Е. С.), а также Уайтхолл Фонд Национального института неврологических расстройств и инсульта и Штайн-Оппенгеймера фонда премии (для БСК).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 Tool VWR international 48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide Reagent Sigma-Aldrich P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Reagent Sigma-Aldrich L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid Reagent Invitrogen 14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red Reagent Invitrogen 51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid Reagent Invitrogen 15140-122
Sodium pyruvate solution Reagent Sigma-Aldrich S8636
HEPES solution 1 M Reagent Sigma-Aldrich H0887
N-2 Supplement (100X), liquid Reagent Invitrogen 17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated Reagent Invitrogen 26050-088
PAPAIN-022 Reagent Worthington Biochemical LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red Reagent Invitrogen 12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid Reagent Invitrogen 17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid Reagent Invitrogen 25030-149
Cell Strainers Tool BD Biosciences 352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile Tool BD Biosciences 353046
NaCl Reagent Sigma-Aldrich S7653
KCl Reagent Sigma-Aldrich P3911
CaCl2 hexahydrate Reagent Sigma-Aldrich 21108
MgCl2 hexahydrate Reagent Sigma-Aldrich M2670
HEPES free acid Reagent Sigma-Aldrich H3375
D-(+)-glucose Reagent Sigma-Aldrich G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO Reagent Invitrogen F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO Reagent Invitrogen P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF Microscope Cargill Labs 16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume Tool Warner Instruments 64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater Tool Warner Instruments 64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids Reagent Invitrogen F8803

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
  2. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
  3. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
  4. Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
  5. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
  6. Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
  7. Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
  8. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
  9. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
  10. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
  11. Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
  14. Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
  15. Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics