Author Produced

Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten

Biology
 

Summary

Beschrijven we een aangepaste DIG

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), e1205, doi:10.3791/1205 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De high-throughput expressie analyse technieken die vandaag beschikbaar zijn geven wetenschappers een overloop van expressie profielen, maar hun resolutie op het gebied van weefsel-specifieke expressie is beperkt als gevolg van problemen in ontleden individuele weefsels. Uitdrukking gegevens moeten worden bevestigd en aangevuld met expressie patronen met behulp van bijvoorbeeld in situ hybridisatie, gebruikt een techniek om lokaliseren cel-specifieke mRNA-expressie. De in situ hybridisatie methode is omslachtig, tijdrovend en vaak vereist uitgebreide optimalisatie, afhankelijk van diersoort en weefsels. In situ experimenten zijn relatief moeilijker uit te voeren in een bosrijke soorten, zoals de conifeer Noorwegen spar (Picea abies). Hier hebben we een gewijzigd DIG in situ hybridisatie protocol, dat is snel en van toepassing op een breed scala aan plantensoorten, waaronder P. abies. Met slechts een paar aanpassingen, zoals gewijzigd RNase behandeling en proteinase K concentratie, kunnen we gebruiken het protocol bij weefselspecifieke expressie van homologe genen in mannelijke voortplantingsorganen van een naaktzadige en twee bloemplant soorten te bestuderen; P. abies, Arabidopsis thaliana en Brassica napus. Het protocol werkt even goed voor de soorten en genen bestudeerd. AtAP3 en BnAP3 werden waargenomen in de tweede en derde krans bloemen organen in A. thaliana en B. napus en DAL13 in microsporophylls van de mannelijke kegels van P. abies. Voor P. abies de proteinase K concentratie, gebruikt om de weefsels permeablize, moest worden verhoogd tot 3 g / ml in plaats van 1 g / ml, mogelijk als gevolg van meer compacte weefsels en hogere niveaus van fenolen en polysachariden. Voor alle soorten van de RNase behandeling werd als gevolg van verminderde signaalsterkte verwijderd zonder een corresponderende toename van de specificiteit. Door het vergelijken van weefsel-specifieke expressie patronen van homologe genen van beide bloeiende planten en een naaldboom we laten zien dat de DIG in situ-protocol hier voorgesteld, met slechts minuten aanpassingen, kan worden toegepast op een breed scala aan plantensoorten. Vandaar dat het protocol voorkomt zowel uitgebreide species specifieke optimalisatie en de moeizame gebruik van radioactief gelabelde probes in het voordeel van DIG gemerkte probes. We hebben ervoor gekozen om de technisch veeleisende stappen van het protocol in onze film te illustreren.

Anna Karlgren en Jenny Carlsson droegen ook voor deze studie.

Overeenkomstige auteurs: Anna Karlgren op Anna.Karlgren @ ebc.uu.se en Jens F. Sundström op Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protocol

Deze niet-radioactieve mRNA in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor Noorwegen vuren weefsels en in detail beschreven. Het is gebaseerd op een Arabidopsis / koolzaad in situ hybridisatie protocol geoptimaliseerd in onze groepen, die op zijn beurt is gebaseerd op de protocollen van de Meyerowitz en Ierse laboratoria en geoptimaliseerd door Vivian Ierse, Cindy Lincoln en Jeff Long onder anderen 1-4.

PROCEDURE

1. FIXATION en inbedding

Om RNA behoud weefsels moeten worden gefixeerd en ingebed in was voor een in situ experiment wordt uitgevoerd. De bevestigings-en inbedding is een cruciale stap, omdat slecht vaste materialen zou kunnen geven een lage of niet detecteerbare signaal ook al is het mRNA is zeer overvloedig. De weefsels zijn uitgedroogd, gewist en ingebed in was in de geleidelijke veranderingen tot beschadiging van het weefsel te voorkomen. Om verder te voorkomen krimp en zwelling van de cellen 0,85% NaCl wordt toegevoegd aan de eerste ethanol stappen in de uitdroging van Noorwegen spar weefsels. Het is mogelijk weg te laten van de NaCl in de ethanol (bijvoorbeeld het is weggelaten in de Arabidopsis / koolzaad protocol). De uitdroging stap tijdens inbedden kan worden uitgevoerd op het ijs om RNase activiteit houden op minimum of bij +4 ° C. In dit protocol de 4% paraformaldehyde fix-oplossing bevat 0,25% glutaaraldehyde, die geacht wordt om een ​​betere RNA retentie geven, ook al is dat sommige mensen beweren dat het waarschijnlijk geen verschil (bijv. wanneer deze wordt gelaten in het Arabidopsis / koolzaad protocol) maakt. Het meest waarschijnlijk een standaard fixatie en inbedding protocol kan worden gebruikt. Zoals te zien is onder de Noorse spar inbedding wijkt enigszins af van de Arabidopsis / koolzaad protocol.

1,1 Dag 1 Verzamelen plantaardig materiaal en paraformaldehyde fixatie

  1. Verzamel het plantmateriaal van belang en ontleden deze indien nodig. Houd de weefsels op ijs en leg ze in ijskoud fix oplossing (zie recepten hieronder) die direct of zo snel mogelijk. NB! Blijf op ijs de hele tijd!
  2. Van toepassing zijn vacuüm de monsters totdat de paraformaldehyde begint te borrelen. Houd de vacuüm voor maximaal drie uur (bijv. 2 x 15 min voor Arabidopsis en koolzaad bloemen weefsels of een uur voor Noorwegen spar mannelijke kegels), en langzaam laat de vacuüm. De weefsels worden verondersteld te zinken na het vacuüm infiltratie van het fixeermiddel, maar voor bepaalde weefsels met een veel lucht is het niet mogelijk is (bv. Arabidopsis bloemen). Een stuk gaas kan worden gebruikt om de weefsels verblijf in het fixeermiddel.
  3. Vervang de fixeermiddel en incubeer bij +4 ° C gedurende de nacht (~ 12-16 uur) zachtjes te schudden.

Optie 1

NB! Noorwegen spar inbedding versie hieronder (stappen 4-8). Zorg ervoor dat scintillatie buizen of glazen flacons worden gebruikt, ten minste in stap 5.

1,2 Dag 2 Uitdroging NB! Noorwegen spar inbedding versie.

  1. 0,85% NaCl 30 min met ijs
    50% EtOH + 0,85% NaCl 90 min met ijs
    70% EtOH + 0,85% NaCl 90 min met ijs
    Pauze! Het is mogelijk om hier te stoppen en de weefsels op te slaan in 70% EtOH + 0,85% NaCl bij +4 ° C voor enkele maanden.
    85% EtOH + 0,85% NaCl 90 min +4 ° C
    95% EtOH (+ eosine) 90 min +4 ° C
    NB! Eosine wordt toegevoegd aan de weefsels vlek roze waardoor ze makkelijker op te sporen tijdens het inbedden en snijden, maar het kan worden uitgesloten.
    100% EtOH (+ eosine) 90 min +4 ° C
    100% EtOH (+ eosine) gedurende de nacht +4 ° C

1,3 Dag 3 Uitdroging en inbedding NB! Noorwegen spar inbedding versie.

    100% EtOH (+ eosine) 2 uur kamertemperatuur
    50% EtOH + 50% Histoclear II 1 uur kamertemperatuur
    100% Histoclear II 1 uur kamertemperatuur
    100% Histoclear II 1 uur kamertemperatuur
    50% Histoclear II + 50% Histowax gedurende de nacht +40-50 ° C
    NB! In de laatste stap van de concentratie van Histowax niet cruciaal is, net giet wat wax chips.

1,4 Dag 4 Embedding NB! Noorwegen spar inbedding versie.

  1. 100% gesmolten Histowax +60 ° C (Wijzigen 's ochtends en' s avonds)

1,5 Dag 5 Embedding NB! Noorwegen spar inbedding versie.

  1. 100% gesmolten Histowax +60 ° C (Wijzigen 's ochtends en' s avonds)

1,6 Dag 6 Embedding NB! Noorwegen spar inbedding versie.

  1. 100% gesmolten Histowax +60 ° C (Wijzigen 's ochtends en' s avonds)
    NB! Het is ok als de was af en toe een keer een dag veranderd, maar dan duurt het twee dagen in beslag een dag van veranderingen. De wax verandering kan ook nog twee extra dagen zonder een probleem. Dit wordt aanbevolen voor grote steekproeven, omdat het helpt de infiltratie van de was in het midden van deze weefsels.

Optie 2

NB! Arabidopsis / koolzaad embedding versie hieronder (stappen 4-8).

1,2 Dag 2 Uitdroging NB! Arabidopsis / koolzaad embedding versie.

  1. NB! Alle stappen bij +4 ° C en voorzichtig schudden, indien niet anders is vermeld.
    1x PBS 30 min
    1x PBS 30 min
    30% EtOH 60 min
    40% EtOH 60 min
    50% EtOH 60 min
    60% EtOH 60 min
    70% EtOH 60 min
    Pauze! Het is mogelijk om hier te stoppen en de weefsels op te slaan in 70% EtOH bij +4 ° C voor enkele maanden.
    85% EtOH 60 min
    95% EtOH (+ eosine) gedurende de nacht
    NB! Eosine wordt toegevoegd aan de weefsels vlek roze waardoor ze makkelijker op te sporen tijdens het inbedden en snijden, maar het kan worden uitgesloten.

1,3 Dag 3 Uitdroging en embeddING NB! Arabidopsis / koolzaad embedding versie.

  1. NB! Alle stappen bij kamertemperatuur en voorzichtig schudden, indien niet anders is vermeld.
    100% EtOH (+ eosine) 30 min
    100% EtOH (+ eosine) 30 min
    100% EtOH (+ eosine) 60 min
    100% EtOH (+ eosine) 60 min
    NB! Overdracht van het weefsel te scintillatieflesjes of andere (glas) injectieflacons.
    75% EtOH + 25% Histoclear II 30 min
    50% EtOH + 50% Histoclear II 30 min
    25% EtOH + 75% Histoclear II 30 min
    100% Histoclear II 60 min
    100% Histoclear II 60 min
    100% Histoclear II + ¼ volumes Histowax chip 's nachts (geen schudden)
    NB! In de laatste stap van de concentratie van Histowax niet cruciaal is, net giet wat wax chips.

1,4 Dag 4 Embedding NB! Arabidopsis / koolzaad embedding versie.

  1. Plaats de flacons met weefsels bij +42 ° C tot de wax chips volledig smelten. Voeg vervolgens ¼ volume van was chips en laat ze volledig smelten. Ga naar +60 ° C en laat de flesjes voor meerdere uren. Tot slot vervang wax / Histoclear II met vers gesmolten was en incubeer overnacht bij +60 ° C.

1,5 Dag 5 Embedding NB! Arabidopsis / koolzaad embedding versie.

  1. 100% gesmolten Histowax +60 ° C (Wijzigen 's ochtends en' s avonds)

1,6 Dag 6 Embedding NB! Arabidopsis / koolzaad embedding versie.

  1. 100% gesmolten Histowax +60 ° C (Wijzigen 's ochtends en' s avonds)
    NB! In de Arabidopsis / koolzaad protocol (in vergelijking met de Noorse spar-protocol) is er een Dag 7 Inbedding in de dezelfde manier als in dag 5-6, dat wil zeggen 100% gesmolten Histowax bij +60 ° C en verandering 's morgens en' s avonds
    NB! Het is ok als de was af en toe een keer een dag veranderd, maar dan duurt het twee dagen in beslag een dag van veranderingen. De wax verandering kan ook nog twee extra dagen zonder een probleem. Dit wordt aanbevolen voor grote steekproeven, omdat het helpt de infiltratie van de was in het midden van deze weefsels.

1,7 Dag 7 Embedding (Dag 8 in de Arabidopsis / koolzaad-protocol) (Film! Technische details worden getoond in de film)

  1. Verwarm de petrischalen en / of schimmels bij +60 ° C. Zet op een hete plaat (+60 ° C) en zorg ervoor dat gesmolten Histowax beschikbaar is.
  2. Giet de weefsels en gesmolten Histowax in een petrischaaltje (of een mal) geplaatst op de hete plaat. Voeg meer Histowax, zodat de weefsels worden gedekt. Verhit een pincet en distributie van de weefsels gelijkmatig in de schaal. Vul de petrischaal (of schimmels). Als de wax hard voordat de weefsels worden in de juiste positie, warmte het weer of verwijder de geharde was met de verwarmde pincet.
  3. Laat de wax blok uitharden op kamertemperatuur voordat u het bij +4 ° C. Het is beter om meerdere wax blokken in plaats van inbedding van de weefsels te strak omdat de wax blok zou kunnen barsten wanneer stukken gesneden tijdens het snijden.
    Pauze! Store bij +4 ° C. De weefsels zijn jaren stabiel.
    NB! Werk RNase vrij van deze stap en verder. Gebruik handschoenen, DEPC-treat MilliQ-water, buffers, glaswerk etc., autoclaaf buffers en bak glaswerk etc. indien nodig.

2. Snijden (Film! Technische details worden getoond in de film)

  1. Zet twee hete platen (+60 ° C en +42 ° C) en zorg ervoor dat gesmolten Histowax beschikbaar is.
  2. Verhit een scalpel en zorgvuldig uitgesneden een wax blok van weefsel van de petrischaal (het zou barsten als er een is te gewelddadig), of verwijderen uit de mal. Wanneer een enkele wax blok is gescheiden, de vorm het stuk in de juiste grootte en vorm aan het snijden in de microtoom te vergemakkelijken.
  3. De was stuk moet een extra wax "hiel" onder het weefsel, zodat het kan worden bevestigd aan het blok houder. Verwarm het blok houder en de hiel op de hete plaat (+60 ° C) en de zekering ze samen. Het kan nodig zijn om op een daling van Histowax II om de fusie stabiel. Laat het uitharden bij +4 ° C.
  4. Snijd de wax blok in 6-8 urn dikke secties aangesloten in een lang lint met behulp van een microtoom.
    NB! Dit wordt gemakkelijker als de wax blok koud is, dat wil zeggen op te slaan de was te blokkeren bij +4 ° C en breng het uit de koelkast bij het ​​starten van het snijden. Het kan ook nuttig zijn om het mes koud te houden.
  5. Onderzoek naar de linten van secties in een vergrootglas en teken de degene te gebruiken.
  6. Zet RNase-vrij MilliQ-water op de dia's (Probe-On Plus van Fisher Biotechnologie, die vooraf gereinigd en opgeladen). Snijd het lint in kleinere stukken en doe ze ("back" of "shiny" kant naar beneden) op de dia's. De dia's met linten moet worden gelegd op een +42 ° C plaat. Het lint moet plat uitgevoerd (dit is belangrijk!) In het water. Laat de secties zitten voor een paar minuten en dan een Kimwipe / tissue papier om afvoer van het water te gebruiken.
  7. Laat de dia's op de plaat voor 1-2 uur.
  8. Incubeer de glaasjes bij +42 ° C gedurende de nacht, zodat de weefsels zich te houden aan dia's.
    Pauze! Het is aanbevolen om de secties te gebruiken zo snel mogelijk, maar ze kunnen droog bewaard worden in gesloten dozen met droogmiddel tot een paar dagen bij +4 ° C.

3. THE MAKING OF VOELERS

In situ hybridisatie detecteert uitdrukking met een gemerkte probe die specifiek is voor een bepaalde mRNA. De sonde, die is meestal een stuk van complementaire RNA, kunnen worden gelabeld met digoxigenine, DIG. DIG is een klein molecuul, die kan worden bevestigd aan uridine en daarmee opgenomen in de RNA-probe en vervolgens gedetecteerd met behulp van DIG-specifieke antilichamen.

Het ontwerpen en het maken van de sonde is de meest kritische stap in een RNA in situ hybridisatie experiment. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de sonde heeft een hoge specificiteit en is voorzien van een hoge kwaliteit UTPs. Soms zijn de hybridisatie temperatuur en / of de reactie lengte moeten worden aangepast voor specifieke probes. Zoals altijd, moet erop worden gelet dat RNase besmetting te voorkomen.

Voor etikettering, een template volgens uw standaard protocollen te isoleren, gebruik, bv. het cDNA-klonen, PCR-fragmenten, en lineariseren de sjabloon. Sense en antisense fragmenten worden geïsoleerd en geamplificeerd uit het sjabloon met behulp van gen-specifieke primers. Voor de PCR geamplificeerde fragmenten geen gebruik maken van enzymen die 3 'overhangen te produceren. Als u alle fragmenten een T7 (of SP6 of T3) overhang wordt toegevoegd met behulp van primers het dragen van de T7-sequentie of met behulp van een vector met een T7-promotor.

Het gevoel (mRNA of (-) streng) probe hebben dezelfde volgorde als de doel-mRNA en zal niet hybridiseren met de doel-mRNA, terwijl de antisense (anti-mRNA of (+) streng) probe hebben de complementaire sequentie en dus hybridiseren met het doel het geven van het signaal van belang. Het gevoel sonde wordt gebruikt als een negatieve controle en geen signaal wordt verkregen als het experiment werkt naar behoren. Een positieve controle is ook nodig, bijvoorbeeld een sonde die een huis-houden-gen ontdekt. De meerderheid van de dia's moet worden gehybridiseerd met antisense probes, terwijl slechts een paar dia's moet worden gehybridiseerd met de verschillende controle-sondes.

3,1 Probe etikettering met behulp van in vitro transcriptie

Reagentia van de DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7, 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Duitsland) of een vergelijkbaar worden gebruikt wanneer het labelen van de sondes. De 20 ul reactie hier beschreven moet ~ 10 pg DIG-gelabelde RNA opbrengst.

  1. Maak een in vitro transcriptie met gemerkte nucleotiden te nemen. Voeg de volgende reagentia aan een buis (te houden op ijs):
    Bestanddeel volume / hoeveelheid
    10 x NTP etikettering mengsel 2 pi
    10 x Transcriptie buffer 2 pi
    Protector RNase-remmer 1 ui (20U)
    RNA-polymerase T7 (SP6 of T3) 2 pi
    Template DNA (500-1000 ng) x ul
    RNase-vrije MilliQ-water y pi, tot een uiteindelijk volume van 18 ui
  2. Meng het NTP etikettering mengsel, transcriptie buffer, RNase-remmer (NB! indien de sonde kort is, bv <500bp, kunt u de RNase-remmer concentratie te verhogen tot 40U), polymerase, template-DNA en het water en vervolgens in het kort centrifuge.
  3. Incubeer het reactiemengsel bij +37 ° C gedurende 2 uur (NB! als de sonde is kort, bijvoorbeeld <500bp, verhoging van de reactietijd op 4-6 uur).
  4. Voeg 2 pl DNase I en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  5. Stop de reactie door het toevoegen van 2 pi 0,2 M EDTA (pH 8,0). Controleer het product op gel.
  6. Neerslag de sonde door het toevoegen van 2,5 ul van 4 M LiCl en 75 pl van> 99,5% ethanol. Meng goed en incubeer bij -20 ° C gedurende de nacht (NB! niet tRNA gebruiken als drager. Gebruik in plaats daarvan glycogeen of acrylamide volgens de fabrikant).
  7. Centrifuge (13 000 rpm) gedurende 30 minuten bij +4 ° C en verwijder het supernatant. Was de pellet (ten minste 10 min 13 000 rpm) twee keer in 70% ethanol (~ 150 tot 300 pi).
  8. Verwijder het supernatant en laat de pellet drogen. Resuspendeer de sonde in 30 ul RNase-vrij water gedurende 1-2 uur op het ijs.
    Pauze! De sonde kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor meer dan een jaar.
    NB! Bespaar 0,5 ul monsters van stap 21 (voor de in vitro transcriptie), stap 23 (voor de DNase behandeling), stap 24 (na de DNase behandeling, maar voor de neerslag) en 1 pi monster uit stap 27 (wanneer de sonde is geresuspendeerd). Voer de monsters op een nondenaturating 1% TBE gel. Als de DNase reactie heeft gewerkt goed de template-band zal verdwijnen. De in vitro transcriptie zou moeten leiden tot een dikke RNA band van ongeveer de juiste afmetingen. Als u meerdere bands, denaturate de monsters bij +80 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door afkoeling op ijs vóór het laden. Als het herstel van stap 27 ziet er slecht uit is het misschien zo zijn omdat de sonde was niet goed geresuspendeerd. Incubeer de RNA bij +55 ° C 5-10 minuten om het te krijgen in de oplossing.

3.2 Hydrolyse van lange probes

NB! Als uw sonde groter is dan 150 bp moet worden teruggebracht tot 50 tot 150 bp tot een hoge signaal, als gevolg van een betere penetratie te geven. De sonde kan chemisch afgebroken in een carbonaat buffer (pH 10,2). Als de sonde is van de juiste maat slaat u de hydrolyse stap, maar vergeet niet om een volume formamide, dat wil zeggen 30 ul, toe te voegen aan de sonde.

  1. Bereid 0,2 M natriumbicarbonaat (NaHCO 3) en 0,2 M natriumcarbonaat (Na 2 CO 3). Beide moeten vers zijn.
  2. Test de twee buffers door het mengen van 5 ml H 2 O, 2 ml 0,2 M NaHCO 3 en 3 ml 0,2 M Na 2 CO 3. De pH moet ~ 10.2.
  3. Bereken de incubatietijd:
    Incubatie tijd (in minuten) = (L 0-L f) / (K * L * L 0 f)
    L = 0 te beginnen lengte van de sonde in de kb
    L f = uiteindelijke lengte van de sonde in kb = bijvoorbeeld 0,100 kb
    K = snelheidsconstante voor de hydrolyse = 0,11 kb-1min-1
  4. Hydrolyseren de helft van uw probe, slaat u de rest voor later. Verdunnen sonde naar 50 ui met RNase vrij water en voeg 20 ul 0,2 M NaHCO 3 (voeg toe eerst) en 30 ul 0,2 M Na 2 CO 3. Mix en incubeer bij +60 ° C voor de berekende incubatietijd.
  5. Stop de reactie door het toevoegen van 10 ul van 1 M NaOAc pH 4,7.
  6. Neerslag de sonde door het toevoegen van 10 pi 4 M LiCl 2 en 300 ul ethanol (NB! Gebruik glycogeen of acrylamide als drager, indien nodig). Incubeer bij -20 ° C gedurende de nacht.
  7. Centrifuge (13 000 rpm) gedurende 30 minuten bij +4 ° C en verwijder het supernatant. Was de pellet twee keer in 70% ethanol (~ 300 ul). Centrifuge (13 000 rpm) ten minste 10 min in elke wasbeurt bij +4 ° C.
  8. Verwijder het supernatant en laat de pellet drogen. Resuspendeer de sonde in 30 ul RNase-vrij MilliQ-water. Voeg een volume formamide, dat wil zeggen 30 ul, de sonde.
    Pauze! De sonde kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor meer dan een jaar.
    NB! Neem 2 ui van het gehydrolyseerd sonde en 2 pl van de gehydrolyseerde probe (voordat de formamide is toegevoegd) en controleren op een nondenaturating 1% TBE gel. Er moet een verschil in grootte tussen de twee monsters. De sondes moet mogelijk worden gedenatureerd bij +80 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door afkoeling op ijs vóór het laden.

4. In situ hybridisatie (Film! Technische details worden getoond in de film)

Zorg ervoor dat alle oplossingen zijn RNase gratis! Het is niet nodig om DEPC-treat alles, maar gebruik in ieder geval geautoclaveerd MilliQ-water. Zorg ervoor dat alle glaswerk verhit worden +200 ° C gedurende de nacht of in ieder geval voor 5 uur. Behandel plastic containers en roer bars met 0,1 M NaOH met agitatie 's nachts. Spoel de plastic containers meerdere malen met geautoclaveerd MilliQ-water (~ 500 ml / container). Het is cruciaal om zorgvuldig te spoelen de containers naar sporen van NaOH dat de hybridisatie zouden kunnen storen te voorkomen. DEPC-treat alle stock-oplossingen, met uitzondering van de Tris-buffers. Controleer alle oplossingen etc. voordat het experiment om ervoor te zorgen dat alles beschikbaar is. Tot en met stap 61 (met uitzondering van de stappen 51-52) houden we de dia's in een rek, die gemakkelijk wordt verplaatst tussen de containers.

4.1 In situ sectie voorbehandeling

  1. Deparaffinize / ontwateren secties:
    2x 10 min Histoclear II (gebruik glazen containers)
    2x 1-2 min. 100% EtOH
    1-2 min. 95% EtOH
    1-2 min. 90% EtOH
    1-2 min. 80% EtOH
    1-2 min. 60% EtOH
    1-2 min. 30% EtOH
    1-2 min. H 2 O
  2. Was de dia's voor 15-20 minuten in 2x SSC bij kamertemperatuur (NB! Bereid de paraformaldehyde gebruikt in stap 42 tijdens de incubatietijd).
  3. Behandel de weefsels gedurende 30 minuten met proteïnase K bij +37 ° C onder zacht schudden (bijv. 1 ug / ml voor Arabidopsis / koolzaad en 3 ng / ml voor Noorwegen spar). Mix en verwarm tot +37 ° C 100 mM Tris pH 8 en 50 mM EDTA. Voeg proteinase K onmiddellijk voorafgaand aan de behandeling van de dia's. NB! De proteinase K behandeling moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van weefsel, plantensoorten en leeftijd. (NB! Bereid de triethanolamine gebruikt in stap 45 tijdens de incubatietijd).
  4. Behandel de dia's voor 2 min met 2mg/ml glycine in 1x PBS bij kamertemperatuur. (NB! Meng de glycine met PBS van de dag alvorens het te gebruiken om ervoor te zorgen dat de glycine goed is opgelost).
  5. Was de dia's voor 2 minuten in 1x PBS bij kamertemperatuur.
  6. Was de dia's voor 2 minuten in 1x PBS bij kamertemperatuur.
  7. Incubeer de glaasjes 10 minuten met 4% (w / v) paraformaldehyd (vers gemaakt) in 1x PBS pH 7 bij kamertemperatuur. Gebruik glascontainer.
  8. Was de dia's voor 5 minuten in 1x PBS bij kamertemperatuur.
  9. Was de dia's voor 5 minuten in 1x PBS bij kamertemperatuur. (Doseer azijnzuuranhydride in de oplossing in stap 45).
  10. Incubeer de glaasjes gedurende 10 minuten in 0,1 M triethanolamine (vers gemaakt, pH 8) en azijnzuuranhydride bij kamertemperatuur.
  11. Was de dia's voor 5 minuten in 1x PBS bij kamertemperatuur.
  12. Was de dia's voor 5 minuten in 1x PBS bij kamertemperatuur.
  13. Ontwateren:
    30 sec 30% EtOH
    30 sec 60% EtOH
    30 sec 80% EtOH
    30 sec 90% EtOH
    30 sec 95% EtOH
    2x 30 sec 100% EtOH
    Pauze! Het is mogelijk om hier te stoppen en de dia's op te slaan in een container met een kleine hoeveelheid van EtOH in de bodem bij +4 ° C gedurende enkele uren.

4.2 In situ hybridisatie (Film! Technische details worden getoond in de film)

Beslis welke dia's te gebruiken, waarmee probes, vergeet dan niet om zowel de sense en antisense probes, evenals een positieve controle gebruiken. (NB! ProbeOn Plus dia's van Fisher Biotechnologie hebben een witte glazuur waarmee ze worden ingeklemd in paren tijdens de hybridisatie / detectie stappen van het protocol.) Hetzelfde probe met dezelfde concentratie dient te worden gebruikt op een specifieke dia paar. Bepalen hoeveel hybridisatie oplossing om op basis van het totale aantal dia's paren. Verwarm de dextraansulfaat in +60 ° C. De hybridisatie-oplossing is zeer viskeus van de dextraansulfaat. Zet de hybridisatie-oplossing in +60 ° C en het zal makkelijker te hanteren. Air-Droog de glaasjes op schone papieren handdoeken of Kimwipe / tissue papieren voordat de sonde wordt toegepast. De dia's moet volledig droog zijn. Voor elk paar dia's toe te voegen de sonde. Het is belangrijk om verschillende probe concentraties (bijvoorbeeld 0,5, 2 en 4 pi) test om de optimale concentratie te vinden, voordat het eigenlijke experiment is voorgevormd.

Hybridisatie-oplossing 5 slide paar 10 slide paren 15 slide paren 20 slide paren
10x in situ zouten 100 pi 200 pi 300 ul 400 ul
gedeïoniseerd formamide 400 ul 800 ul 1200 ui 1600 ui
50% dextransulfaat (+60 ° C) 200 pi 400 ul 600 ul 800 ul
50x Denhardt's oplossing 20 pl 40 pi 60 pl 80 pl
tRNA (100mg/ml) 10 pi 20 pl 30 pl 40 pi
H 2 O (DEPC behandeld) 70 pl 140 ul 210 ul 280 ul
Totale volume 800 ul 1600 ui 2400 ui 3200 ui
  1. Verdun de sonde in RNase-vrij MilliQ-water tot een eindvolume van 20 ul. Voeg een volume (dwz 20 ul) formamide van de sonde het geven van een totaal volume van 40 pi. Verwarm de sonde tot 80 ° C gedurende 2 minuten. Plaats op ijs gedurende 2 minuten. Spin down. Houd de sonde op het ijs. Deze probe-mengsel is genoeg voor een paar dia's. Vermenigvuldig volgens het totale aantal dia paren voor de specifieke probe.
  2. Voeg 160 ul van hybridisatie-oplossing voor elk paar dia's geven een uiteindelijk volume van 200 ul (dat wil zeggen 160 ul hybridisatie-oplossing + 40 pi probe) voor elke dia paar. Mix zonder het genereren van bubbels.
  3. Breng de sonde naar de ene dia en langzaam samensmelten van de twee dia's. (NB! daartussen kan alleen worden gedaan met de Probe-On Plus dia's, dia's of gelijkwaardig. Als dia's zonder glazuur worden gebruikt gebruik dekglaasjes in plaats van sandwichen.)
  4. Verheffen dia's boven natte papieren handdoeken in een plastic container (die strak dichtingen) met behulp van plastic pipetten. Hybridiseren +50-55 ° C gedurende de nacht (12-16 uur).

4.3 In situ hybridisatie bericht (Film! Technische details worden getoond in de film)

  1. Bereid de in situ hybridisatie bericht door opwarming ~ 2 L 0,2 x SSC (+55 ° C) en ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) gedurende de nacht. Meer SSC en NTE zijn nodig als het RNase behandeling (57-59 stappen hieronder) wordt uitgevoerd.
  2. Dip elke dia paar in warme 0,2 x SSC (zie boven) te scheiden en spoel ze af. En plaats ze in een rack in een containermet warme 0,2 x SSC.
  3. Was de dia's voor 60 min in 0,2 x SSC onder zacht schudden bij +55 ° C. (NB! Bereid de Boehringer blok oplossing die wordt gebruikt in stap 63 tijdens de incubatietijd).
  4. Herhaal het wassen in 0,2 x SSC gedurende 60 minuten. (NB! Als het RNase stap is uitgevoerd laat het RNase dooi tijdens deze incubatie, zo niet doorgaan met 60 stap.)
  5. Optioneel: Was de dia's voor 5 min in warm 1x NTE (zie boven) bij +37 ° C onder zacht schudden.
  6. Optioneel: Herhaal de wassen in warm 1x NTE gedurende 5 minuten bij +37 ° C met zachte agtation.
  7. Optioneel: Behandel de dia's met RNase (20 ug / ml RNase A in 1x NTE) gedurende 30 minuten bij +37 ° C onder zacht schudden. Was daarna voor 5 min in 1x NTE bij +37 ° C onder zacht schudden. Herhaal de NTE 1x wassen.
  8. Was de dia's voor 60 min in 0,2 x SSC bij +55 ° C onder zacht schudden. (NB! Bereid het blok oplossing die wordt gebruikt in de stappen 64 tot 65 en 67 tijdens de incubatietijd).
  9. Was de dia's voor 5 min in 1x PBS bij kamertemperatuur (Pause! U kunt dia's opslaan in 1XPBS bij +4 ° C gedurende de nacht als je wilt de volgende dag voort te zetten.)
  10. Plaats de dia's op de bodem van een grote plastic container met het monster naar boven.
  11. Incubeer de glaasjes met 1% Boehringer blok in 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl gedurende 45 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Alleen betrekking hebben op de dia's met de blokkering oplossing. Giet de blokkering oplossing, terwijl de dia's nog in de plastic container of plaats de dia's in een nieuwe container. Wanneer het gieten van uit de oplossing van de dia's doorgaans houden aan de plastic container, maar zorg ervoor dat ze niet uitvallen uit de container.
  12. Vervang de Boehringer blok oplossing met 1,0% BSA in 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Voer de incubatie als in stap 63.
  13. Verdun de anti-dig antilichamen (1:1250, dat wil zeggen 8 ul-antilichamen in 10 ml BSA) in de BSA / Tris / NaCl / Triton oplossing van stap 64. Maak een plas antilichaam oplossing in een plastic wegen schotel. Sandwich dia's samen te laten capillaire krachten op te trekken van de oplossing. Laat ze uitlekken op Kimwipe / zijdepapier en herhaal, probeer om luchtbellen te vermijden.
  14. Verheffen dia's boven natte papieren handdoekjes in plastic container en laat de dia's om bij kamertemperatuur te zitten gedurende 2 uur.
  15. Drain dia's op Kimwipe / zijdepapier en te scheiden. Plaats aan de onderkant van plastic container als in stap 63. Was 4x in de BSA / Tris / NaCl / Triton-oplossing. 15 min elke keer, zacht schudden bij kamertemperatuur.
  16. 10 min 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2. Plaats aan de onderkant van plastic container als in stap 63.
  17. Dip dia in Tris pH 9.5/NaCl/MgCl 2-oplossing om alle detergent verzekeren is weggespoeld.
  18. Maak broodjes en het opstellen van West-blauwe oplossing als in 65. Herhaal een keer.
  19. Plaats de glaasjes in plastic container boven natte papieren handdoekjes in totale duisternis (wikkel in aluminiumfolie) voor 1-5 dagen bij kamertemperatuur. Controleer na 6, 12 en 24 uur, dan eenmaal per dag.
  20. Giet dia's, afspoelen in 1xTE om de reactie te stoppen. Doe dekglaasjes voordat de dia's worden onderzocht in de microscoop. De dia's kunnen worden opgeslagen in 1x TE voor enkele maanden, maar foto's maken zo snel mogelijk.

RECEPTEN / Stamoplossingen

NB! Gebruik RNase-vrij MilliQ-water zo veel mogelijk, bijvoorbeeld DEPC-treat MilliQ-water (voeg 0,1% DEPC. Laat een nacht. Autoclaaf (20 minuten bij 15 psi, dat wil zeggen 1,05 kg / cm 2, op de vloeistof cyclus) of gebruik bij minst geautoclaveerd MilliQ-water. Bij de voorbereiding buffers en voorraad-oplossingen is het ook mogelijk op te lossen RNase-vrije zouten enz. in DEPC-behandeld water, in plaats van DEPC-behandeling van de buffers en voorraad-oplossingen zelf. Als je niet DEPC-treat water , buffers en voorraad-oplossingen, in ieder geval autoclaaf of filter steriliseren ze.
Pauze! Store buffers en stock-oplossingen bij kamertemperatuur, indien niet anders is vermeld.
NB! U vindt veel van de buffers en tips over hoe om ze te maken in Molecular Cloning (Sambrook, J., en DW Russell. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 3 ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA).

Azijnzuuranhydride in 0,1 M triethanolamine (pH 8, volume: 800 ml).

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
Triethanolamine 10,4 ml 0,1 M triethanolamine
MilliQ-water 786,4 ml uiteindelijke volume 800 ml
HCl 3,2 ml het geven van pH8.0
Azijnzuuranhydride 4,8 ml 0,6%
  • Naar 0,1 M triethanolamine buffer, pH 8,0, verdund 10,4 ml triethanolamine in 786,4 ml H 2 O te maken en voeg 3,2 ml van HCl om de pH op 8.0 (controleren met pH-indicator).
  • Verheffen slide rack met een gebroken 10 ml plastic pipetten of vergelijkbaar in een container van triethanolamine met een roerstaafje in de bodem.
  • Verdeel 4,8 ml azijnzuuranhydride in de triethanolamine een paar minuten voordat dia's in, zodat het goed gemengd is.

NB! Maak de 0,1 M triethanolamine frisse en voeg azijnzuuranhydride vlak voor de incubatie.
NB! Gebruik glascontainer. Triëthanolamine buffer moet worden gebruikt, omdat azijnzuuranhydride is instabiel in water.

Agarose (1%) gel in 1 x TBE (volume: 100 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
Agarose 1 g 1%
1 x TBE tot 100 ml

Meng agarose met 1 x TBE. Warmte / kook totdat de agarose is gesmolten. Wierp een gel. Voer de gel in een 1 x TBE buffer.

Dextransulfaat

Vul 5 g dextraansulfaat tot 10 ml met DEPC behandeld MilliQ-water (dat wil zeggen 50% (w / v)) en los op in 60 ° C.
Pauze! Bewaren bij -20 ° C.

0,5 M EDTA pH8.0 (Titriplex III, volume 500 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
EDTA (372,24 g / mol) 93,06 g 0,5 M EDTA
MilliQ-water tot 500 ml
NaOH ~ 10 g pellets het geven van pH 8,0
DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC

Los EDTA in water (gebeurt bij pH 8,0), aan te passen aan een uiteindelijk volume van 500 ml. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

Fix oplossing / fixatief (stappen 1-3, 42) - 4% (w / v) paraformaldehyde in 1x PBS, pH 7,0 (650 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
MilliQ-water 585 ml
10x PBS 65 ml 1x PBS
10M NaOH 520 ul het geven van pH ~ 11
Paraformaldehyde 26 g 4%
Geconcentreerd HCl 449 ul het geven van pH ~ 7
  • Meng water, PBS en NaOH en warmte aan +60-70 ° C (de temperatuur en de hoge pH-waarde zal het gemakkelijker maken om het paraformaldehyde te ontbinden.
  • Toevoegen (in zuurkast) paraformaldehyde.
  • Wanneer de oplossing is verdwenen plaats deze op ijs en breng de pH op 7,0 door toevoeging van 449 ul geconcentreerd HCl.

NB! Het maken van verse.
NB! In de spar protocol glutaraldehyde werd toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 0,25%, dat wil zeggen 6,5 ml 25% glutaraldehyde om het totale volume van 650 ml of 10 ml 25% glutaraldehyde om het totale volume van 1000 ml (denk aan het water te verminderen met een gelijke volume).
NB! Voeg een paar druppels van Tween 20 en / of Triton X-100, na de pH wordt aangepast, om de oppervlaktespanning te reduceren tot de fixatie te vergemakkelijken in stappen 1-3. NIET gebruiken in stap 42!
NB! Bij de vaststelling van plantenweefsels een kleiner volume (bijv. 100 - 200 ml) van fixatief is over het algemeen nodig is.

10x in situ zouten (volume 100 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
5 M NaCl 60 ml 3M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8,0 10 ml 0.100 M Tris
1 M Na fosfaat pH 6,8 10 ml 0,100 M Na Fosfaat
0,5 M EDTA 10 ml 0,050 M EDTA
MilliQ-water tot 100 ml

Meng een Na-fosfaat buffer met pH 6,8 (46,3 ml 1 M Na 2 HPO 4 + 53,7 ml 1 M NaH 2 PO 4). Mix NaCl, Tris, Na fosfaatbuffer, EDTA en water. Autoclaaf. Pauze! Bewaren bij -20 ° C.

4 M LiCl 2 (lithium chloride, volume: 100 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
LiCl 2 (42,39 g / mol) 16.956 g 4M LiCl 2
MilliQ-water tot 100 ml
DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC

Los LiCl 2 in water, aan te passen aan een eindvolume van 100 ml. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.
Pauze! Bewaren bij +4 ° C.

1 M MgCl 2 · H 2 O (magnesium chloride, volume: 100 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol) 20,33 g 1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ-water tot 100 ml
DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC

Los MgCl 2 in water, aan te passen aan een eindvolume van 100 ml. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.
NB! MgCl 2 is zeer hygroscopisch. Bewaar geen geopende flessen voor langere tijd.

5 M NaCl (natriumchloride, volume: 1 l)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
NaCl (58,44 g / mol) 292,2 g 5 M NaCl
MilliQ-water tot en met 1l
DEPC 1 ml 0,1% DEPC

Los NaCl in water, aan te passen aan een eindvolume van 1 l. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

1 M NaOAc pH 4,7 (natriumacetaat, volume: 100 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
NaOAc (82,03 g / mol) 0,8203 g 1 M NaOAc
MilliQ-water tot 100 ml
Azijnzuur het geven van pH 4,7
DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC

Los NaOAc in het water. Stel de pH op 4,7. Aan te passen tot een uiteindelijk volume van 100 ml. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

0,2 M Na 2 CO 3 pH11.4 (natriumcarbonaat, volume: 10 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
Na 2 CO 3 0,21198 g 0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4
MilliQ-water tot 10 ml

Los Na 2 CO 3 in water, aan te passen aan een eindvolume van 10 ml. De pH moet 11,4.
NB! Het maken van verse.

0.2 M NaHCO 3 pH8.2 (natriumbicarbonaat, volume: 10 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
NaHCO 3 0,16802 g 0.2 M NaHCO 3: pH = 8,2
MilliQ-water tot 10 ml

Los NaHCO 3 in water, aan te passen aan een eindvolume van 10 ml. De pH moet 8,2.
NB! Het maken van verse.

1 M Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (volume 500 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol) 88.995 g 1 M Na 2 HPO 4
MilliQ-water tot 500 ml
DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC

Los Na 2 HPO 4 in het water, aan te passen aan een uiteindelijk volume van 500 ml. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

1 M NaH 2 PO 4 · H 2 O (volume 500 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) 68.995 g 1 M NaH 2 PO 4
MilliQ-water tot 500 ml
DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC

Los NaH 2 PO 4 in het water, aan te passen aan een uiteindelijk volume van 500 ml. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

5x NTE (totaal volume: 1l)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
5 M NaCl 500 ml 2,5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8 25 ml 50 mM Tris-Cl pH 8
0,5 M EDTA 5 ml 5 mM EDTA
MilliQ-water 470 ml eindvolume 1l

Mix NaCl, Tris, EDTA en water. Niet DEPC-treat. Autoclaaf.

10 x PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) pH 7,0 (totaal volume: 1l)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
5 M NaCl 260 ml 1,3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4 70 ml 70 mM Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4 30 ml 30 mM NaH 2 PO 4
MilliQ-water 640 ml eindvolume 1l
DEPC 1 ml 0,1% DEPC

Mix NaCl, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 en water. Breng de pH op pH 7.0 met HCl. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

20x SSC pH 7,0 (totaal volume: 1l)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
NaCl (58,44 g / mol) 175,32 g 3 M NaCl
Na Citraat (294,1 g / mol) 88,23 g 0,300 M Na Citraat
MilliQ-water tot 1 liter
HCl het geven van pH 7,5
DEPC 1 ml 0,1% DEPC

Los NaCl en Na Citraat in ~ 800 ml water. Breng de pH op pH 7.0 met HCl. Pas het volume aan tot 1 liter met water. Voeg 0,1% DEPC. Laat 's nachts. Autoclaaf.

5 x TBE (volume: 1l)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
Tris (121,14 g / mol) 54 g ~ 0,45 M Tris
Boorzuur (61,83 g / mol) 27,5 g ~ 0,45 M boorzuur
EDTA (372,24 g / mol) 3,7 g ~ 0,01 M EDTA
MilliQ-water tot en met 1l

Mix Tris, boorzuur, EDTA en water. De pH moet ~ 8.3. Vul aan tot 1 x TBE voor gebruik.

10 x TE pH 8,0 (Tris EDTA, volume: 1 l)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
1 M Tris-Cl, pH 8,0 100 ml 0.100 M Tris-Cl
0,5 M EDTA pH8.0 100 ml 0,050 M EDTA
MilliQ-water tot en met 1l

Mix Tris, EDTA en water. Niet DEPC-treat. Autoclaaf.
NB! Tris mag niet worden DEPC behandeld! Gebruik RNase-vrij poeder en verdunnen met DEPC-treated/RNase-free MilliQ-water.

1 M Tris-HCl pH 7,5 tot 9,5 (volume 500 ml)

Bestanddeel volume / hoeveelheid uiteindelijke concentratie
Tris (121,14 g / mol) 60,57 g 1 M Tris
MilliQ-water tot 500 ml
HCl het geven van pH 7,5
HCl het geven van pH 8,0
NaOH het geven van pH 9,5

Los Tris in DEPC-behandeld water. Aan te passen aan de gewenste pH. Aan te passen aan een uiteindelijk volume van 500 ml. Autoclaaf.
NB! Tris mag niet worden DEPC behandeld! Gebruik RNase-vrij poeder en verdunnen met DEPC-treated/RNase-free MilliQ-water.
NB! In Molecular Cloning (zie hierboven) is er een tabel beschrijven hoeveel concentreren HCl nodig is om de juiste pH te bereiken.

MATERIAAL EN METHODEN

De in-situ-protocol wordt gepresenteerd boven en in de film. Hier aanvullende informatie van het plantmateriaal en probes die in dit specifieke voorbeeld worden beschreven.

Plantmateriaal en de experimentele opzet

Mannelijke kegels van Picea abies [L.] Karst. (Noorwegen spar) werden verzameld in Uppsala, Zweden, najaar 2007. Acht kegels werden coupes en profielen uitelke kegel werden gebruikt in elke behandeling. Drie proteinase K-concentraties werden getest, 1, 3 en 5 ug / ul en elke concentratie werden behandeld met of zonder RNase. Dia's niet behandeld worden met RNase werden achtergelaten in PBS tijdens de RNase behandeling. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. en Brassica napus L., werden gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden in een cultuur kamer met 22 ° C/18 ° C dag / nacht temperaturen en een lichtperiode van 16 uur Jonge bloeiwijzen met bloemen knoppen, podia 0-10 (stadia volgens Smyth 5) werden bestudeerd.

cRNA sondes

Totaal RNA werd geïsoleerd uit P. abies mannelijke kegels zoals eerder beschreven 6 en van A. thaliana en B. napus met behulp van TRIzol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, USA) en de Qiagen RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland), respectievelijk, in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant. Het cDNA werd gesynthetiseerd 0,5 tot 1 ug totaal RNA, afhankelijk van de soort, met behulp van Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) volgens de instructies van de fabrikant. AtAP3 en BnAP3 sense en antisense fragmenten en P. abies zin fragmenten werden geïsoleerd en geamplificeerd met behulp van gen-specifieke primers (Tabel 1). DAL13 antisense fragmenten werden geïsoleerd en geamplificeerd met behulp van primers zoals in 7. Een T7 overhang werd toegevoegd aan fragmenten van A. thaliana en P. abies met behulp van aangepaste reverse primers het dragen van de T7-sequence (tabel 1). Een 500 bp fragment werd geïsoleerd met behulp van BnAP3 specifieke primers (Tabel 1) en gekloneerd in een pGEM-T vector met een T7-promotor. Voor de P. abies fragmenten alle PCR-reacties werden uitgevoerd in een eindvolume van 20 ul met 0,2 U Phusion High-Fidility DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland), 1x Phusion HF buffer, 200 uM van elke dNTP, 0,3 pM van elk primer en 25-50 ng cDNA en een standaard PCR-programma werd gebruikt met een annealing temperatuur van 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / cyclus), gevolgd door 55 ° C. Sense en antisense cRNA sondes voor alle drie de soorten werden gesynthetiseerd met in vitro transcriptie met behulp van de DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Duitsland) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en de lange probes werden verteerd tot ongeveer 100-150 bp fragmenten met behulp van een Na 2 CO 3 buffer volgens 3.

RESULTATEN

Hier in het resultaat paragraaf beschrijven we drie verschillende voorbeelden van typische resultaten van in situ experimenten.

De genetische mechanisme dat reproductieve ontwikkeling reguleert in naaktzadigen en bedektzadigen door het specificeren mannelijke en vrouwelijke organen identiteit lijkt te zijn evolutionair geconserveerd 7-9, ondanks dat de twee zaadje plant lijnen gescheiden zijn 285 miljoen jaar geleden 10. In A. thaliana de bloemen homeotische genen APETALA3 (AP3 11) en pistillata (PI 12) zijn noodzakelijk en voldoende om mannelijke reproductieve ontwikkeling te geven in het kader van een bloem, en deze functie lijkt te zijn geconserveerd in de angiosperm lijn 13. In gymnospermen, die bloemen gebrek en hebben hun voortplantingsorganen gerangschikt in aparte mannelijke en vrouwelijke kegels (fig. 1A-C), genen die homoloog zijn aan AP3 en PI zijn specifiek tot uiting in de pollen met organen van de mannelijke kegel, de microsporophylls 7,14. Vandaar dat een gelijkaardige set van homologe genen in zowel de angiospermen en gymnospermen definieert de stuifmeel-dragende organen.

Gen specifieke probes gericht tegen AtAP3 en BnAP3, respectievelijk, gaf signalen van fase 3 bij jonge bloemen knoppen in een regio die overeenkomt met krans twee en drie in A. thaliana en B. napus. In latere geënsceneerde knoppen de signalen werden beperkt tot het ontwikkelen van bloemblaadjes en meeldraden (fig. 2A en B). Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere studies 11,15,16. Probes gericht op de AP3 homoloog in P. abies, DAL13, geproduceerd signalen in het microsporophylls van P. abies mannelijke kegels zowel voor als na de beëindiging apicale meristeem (Fig. 2C en D), zoals verwacht van eerdere studies 7,14. Sense sondes gaf geen signaal boven de achtergrond (Fig. 3A-B en de gegevens niet getoond). Tezamen bieden deze resultaten tonen uitdrukking van A. thaliana AP3 en zijn orthologen in B. napus en P. abies in de ontwikkeling van mannelijke voortplantingsorganen.

Figuur 1. A.thaliana en B. napus bloemen en pollen produceren mannelijke kegels van de conifeer P. abies foto's tonen bloeiwijzen met bloemen knoppen en open bloemen van A.thaliana en B.napus in A en B respectievelijk. Merk op dat angiosperm bloemen, afgezien van de steriele bloemdek zowel mannelijke als vrouwelijke geslachtsorganen havens, meeldraden en vruchtbladen. Afgebeeld in C is een takje van de naaktzadige P. abies met groene en rode naalden vegetatieve voortplanting mannelijke kegels.

Figuur 2. Expressie van A. thaliana AP3 en homologe genen in B. napus en P. abies. Micrografen tonen longitudinale secties van A. thaliana en B. napus bloeiwijzen in A en B, respectievelijk P. abies mannelijke kegels in C en D. Secties gehybridiseerd met antisense probes gericht tegen AtAP3 in A en B tonen BnAP3 in het signaal op de tweede en derde krans bloemen organen. Cijfers geven bloemen stadia volgens Smyth 5. Antisense probe gericht op de DAL13 gen gaf signaal in het stuifmeel dragende microsporophylls van P. abies mannelijke kegels, zoals getoond in CD. Voorbeelden van microsporophylls zijn aangegeven met pijlen. Pijlpunten in AD wijzen op hybridisatie-signaal, dat verschijnt als paars. In C en D fenolische verbindingen geven bruinachtige vage kleur aan individuele cellen in het centrale merg. s, kelkblad, p, bloemblaadje, st, meeldraden, c, carpel, ms, microsporophyll, pi, merg, pp, pre-pollen cellen. Bar: 100 urn.

Figuur 3. DAL13 uitdrukking in mannelijke kegels van P. abies. Alle micrografen (AH), zijn die in de lengte delen van de mannelijke kegels na het apicaal meristeem beëindiging. Pijlpunten wijzen op celtypes waarin DAL13 wordt uitgedrukt. Secties in A en B zijn gehybridiseerd met een gevoel control sonde naar achtergrondkleuring te bepalen. Micrografen C tot en met H worden gehybridiseerd met een DAL13 antisense sonde. Secties van experimenten met en zonder RNase behandeling zijn weergegeven in D, F, H en C, E, G respectievelijk. Micrografen van experimenten met 1 ug / ml proteinase K zijn weergegeven in C en D, 3 ug / ml in E en F, en 5 ug / ml in G en H. Bar: 100 urn.

Discussion

Twee aspecten van de P. abies protocol werden geoptimaliseerd ten opzichte van de A. thaliana / B. napus protocol, RNase behandeling en proteinase K concentratie. De RNase verwijdert achtergrond signalen en verhoogt zo het signaal specificiteit 17. De proteinase K behandeling is nodig om de weefsels permeabilize, zodat de sonde kunt invoeren en hybridiseren met het RNA pool van belang. De DAL13 antisense probe gaf een hogere signaal zonder RNase-behandeling (Fig. 3C, E, G) in vergelijking met secties behandeld met RNase gedurende 30 minuten (figuur 2D, F en H). Sinds de RNase-behandeling niet verbeteren het signaal dat werd verwijderd uit het protocol. De proteinase K behandeling werden getest op drie verschillende concentraties, 1, 3 en 5 ug / ml. In het geval van P. abies een lage of geen signaal werd waargenomen met behulp van 1 ug / ml proteinase K (fig. 3C-D). Een sterk signaal werd verkregen met zowel 3 ug / ml (Afb. 3E-F) en 5 ng / ml (afb. 3G-H) proteïnase K. Aangezien er geen duidelijk verschil in signaalsterkte werd gevonden bij het gebruik van 5 ug / ml proteinase K in vergelijking met 3 ug / ml, hebben we ervoor gekozen om 3 ug / ml te gebruiken in ons protocol. Het is waarschijnlijk dat de noodzaak van een hogere proteinase K concentratie in de P. abies mannelijke kegels ten opzichte van de A. thaliana en B. napus bloemen knoppen is te wijten aan compacter weefsel met hogere niveaus van fenolen en polysachariden.

Tijdens de fixatie en inbedding enkele verschillen tussen de A. thaliana / B. napus protocol en de P. abies protocol zijn evident. Het weefsel van belang is vast te RNA retentie te bieden en dit is een belangrijke stap, omdat slecht vaste materialen zou kunnen geven een lage of niet detecteerbare signaal ook al is het mRNA is zeer overvloedig. Het weefsel is uitgedroogd, gewist en ingebed in was in de geleidelijke veranderingen van weefsel schade te voorkomen, en in sommige protocollen 0,85% NaCl wordt toegevoegd aan de ethanol in de uitdroging te vermijden om verdere krimp en zwelling van de cellen 3. De uitdroging stap tijdens inbedden kan worden uitgevoerd op het ijs om RNase activiteit houden minimum te beperken. In de P. abies protocol van de 4% paraformaldehyde fix-oplossing bevat 0,25% glutaaraldehyde, die geacht wordt om een betere RNA retentie geven 17 ook al is dat sommige mensen beweren dat het waarschijnlijk geen verschil 3 te maken. Na het snijden van het materiaal is bevestigd op dia's en voorbehandeld (dat wil zeggen was ontdaan, gerehydrateerd, gepermeabiliseerde, getrakteerd op niet-specifieke binding van de probe en tenslotte gedroogd te verminderen) voor de hybridisatie.

In het protocol hier gepresenteerde de hele detectie-procedure kan worden uitgevoerd in gewone laboratoria, het signaal ontwikkelt zich meestal binnen 1-3 dagen en de verhouding tussen signaal over achtergrond kan doorlopend worden gecontroleerd. Het DIG-gelabelde probes meestal geven een duidelijker signaal in vergelijking met radioactief gelabelde probes, zijn stabieler en kan worden hergebruikt in opeenvolgende experimenten. Aan de andere kant, is de gevoeligheid verminderd in vergelijking met radioactieve probes 17. In situ hybridisatie detecteert uitdrukking met een gemerkte probe die specifiek is voor een bepaalde mRNA. Radioactieve labeling is een robuuste en gevoelige etikettering methode, maar het vereist de behandeling van radioactiviteit en het duurt enkele weken voordat de resultaten kunnen worden gedetecteerd. Antigeen-gelabelde probes aan de andere kant, zijn stabieler, minder gevaarlijk en vereisen de blootstelling aan de detectie medium voor een paar dagen maar 17. Zo zijn antigeen-labelling methoden die momenteel domineert. De meest kritische fase, ongeacht het protocol is de sonde ontwerp. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de sonde heeft een hoge specificiteit en is voorzien van een hoge kwaliteit UTPs. Soms zijn de hybridisatie temperatuur en / of de reactie lengte moeten worden aangepast voor specifieke probes.

Onze gewijzigd protocol op basis van DIG-gelabelde probes zal vergemakkelijken lokalisatie van mRNA-expressie tegelijk in soorten, variërend van A. thaliana aan P. abies, en moet met kleine aanpassingen bruikbaar in andere plantensoorten. Het protocol heeft, naast de mannelijke kegels, is ook getest op verschillende stadia van vegetatieve scheuten en in zowel zygotische en somatische embryo's van P. abies met goede resultaten (niet gepubliceerde resultaten;. Karlgren et al.).

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn erg dankbaar Anders Bovin, die op voorwaarde dat de muziek voor onze film en Michael Elliot Stocks voor vrijwilligerswerk aan de spreker stem. Ondersteuning werd geleverd door Carl Trygger Foundation, het strategisch onderzoeksprogramma Agricultural Functional Genomics (AgriFunGen) aan de Zweedse University of Agricultural Sciences, de Zweedse Research Council (VR), en de Zweedse Onderzoeksraad voor Milieu, Agricultural Sciences, en Ruimtelijke Ordening (Formas ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride Sigma-Aldrich A6404-200ml minimum 98%
Acrylamide, linear Ambion 9520
Anti-DIG-antibodies Roche Group
Blocking reagent Roche Group 11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-50g minimum 98%
Deionized formamide Sigma-Aldrich
Denhardts solution Sigma-Aldrich D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich
Dextran sulfate Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Roche Group 11175025910
Glutaraldehyde (25%) Histolab
Glycogen Ambion 9510G
Histoclear II Histolab You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax Histolab Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500g
Paraplast plus Sigma-Aldrich P3683-1kg Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase Finnzymes
Probe-on Plus slides Fisher Scientific 22-230-900
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5mg
RNase A Sigma-Aldrich R5503-100mg
Tissue-clear Sakura Finetek You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine Sigma-Aldrich T1377-100ml minimum 98%
Triton X-100 use your standard product in the lab Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA Sigma-Aldrich 83853-100mg
Tween-20 use your standard product in the lab Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue Promega Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carr, S. M., Irish, V. F. Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica. Planta. 201, (2), 179-188 (1997).
  2. Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. Nature. 353, (6339), 31-37 (1991).
  3. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Patology: a practical approach. Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. University Press. Oxford. (1991).
  4. Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. In situ hybridization: a practical guide. BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford. (1994).
  5. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, (8), 755-767 (1990).
  6. Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 333-338 (2003).
  7. Sundstrom, J., et al. MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms. Dev Genet. 25, (3), 253-266 (1999).
  8. Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms. Plant J. 15, (5), 615-623 (1998).
  9. Winter, K. U., et al. MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (13), 7342-7347 (1999).
  10. Savard, L., et al. Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (11), 5163-5167 (1994).
  11. Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens. Cell. 68, (4), 683-697 (1992).
  12. Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. Genes directing flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 1, (1), 37-52 (1989).
  13. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, (6732), 144-148 (1999).
  14. Sundstrom, J., Engstrom, P. Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia. Plant J. 31, (2), 161-169 (2002).
  15. Carlsson, J., et al. Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers. Plant J. 49, (3), 452-462 (2007).
  16. Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus. Plant J. 42, (5), 731-742 (2005).
  17. Ying, S., Kay, A. B. The technique of in situ hybridization. Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).

Comments

1 Comment

  1. The ISCT mold inspection network provides on-call mold testing services 7 days a week. Since 1997, they have earned a reputation for honesty, integrity, ethics and premium customer service. Because of this, they have become one of the largest mold inspection companies in the nation. With a network of mold inspector employees and affiliates located throughout the United States, they have the resources, manpower, equipment, and expertise to help you with your mold testing needs and get the job done - quickly and efficiently. You want to get quick results in order to get a plan of action ready, they can steer you in the right direction. So contact with them as soon as possible.

    Robart Thomas

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 4, 2010 - 4:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics