Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

Biology

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Summary

Objektiv Entwicklung beinhaltet Wechselwirkungen mit anderen Geweben. Mehrere Zebrafisch Auge Mutanten sind durch eine abnormal kleine Linse Größe aus. Hier zeigen wir eine Linse Transplantation experimentieren, um festzustellen, ob dieser Phänotyp durch inneren Ursachen oder defekte Interaktion mit Gewebe, die das Objektiv umgeben ist.

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Zhang, Y., McCulloch, K., Malicki, J. Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants. J. Vis. Exp. (28), e1258, doi:10.3791/1258 (2009).

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Abstract

Das Objektiv spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Augenbecher [1,2]. Mit der Zebrafisch als Modellorganismus, können Fragen zur Linse Entwicklung angesprochen werden. Der Zebrafisch ist nützlich für genetische Studien durch mehrere vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich der kleinen Größe, hohe Fruchtbarkeit, kurzen Lebenszyklus und Pflegeleichtigkeit. Objektiv Entwicklung erfolgt rasch im Zebrafisch. Um 72 HPF, ist die Zebrafisch-Objektiv funktionell ausgereift [3]. Reichlich genetischen und molekularen Ressourcen zur Verfügung stehen, die Forschung im Zebrafisch zu unterstützen. Darüber hinaus bietet die Ähnlichkeit der Zebrafisch-Auge mit denen anderer Wirbeltiere Grundlage für seine Verwendung als ein hervorragendes Tiermodell der menschlichen Mängel [4-7]. Mehrere Zebrafisch-Mutanten weisen Objektiv Anomalien, einschließlich hohe Zelltod, der in einigen Fällen zu einer vollständigen Degeneration der Linse Gewebe [8].

Um festzustellen, ob Objektiv Anomalien aufgrund von inneren Ursachen oder fehlerhafter Interaktionen mit dem umgebenden Gewebe, ist die Transplantation einer Mutante Objektiv in einem Wildtyp-Auge durchgeführt. Mit Feuer-poliertem Metall Nadeln, mutierte oder Wildtyp-Objektive sind sorgfältig aus dem Spendertier seziert, und in die Host. Zur Unterscheidung Wildtyp und Mutante Gewebe, ist eine transgene Linie als Spender verwendet. Diese Linie drückt Membran-gebundenen GFP in allen Geweben, einschließlich der Linse. Diese Transplantation Technik ist ein wichtiges Instrument in den Studien von Zebrafisch-Mutanten-Objektiv.

Protocol

Teil 1: Vorbereitung der Embryonen

In diesem Protokoll werden wir die jj xy Symbol, um eine hypothetische Zebrafisch-Mutante Linse bezeichnen.

  1. Zebrafisch-Stämme sind in Standard-Fisch-Anlage Bedingungen bei 28,5 C auf einem 14h light/10h Dunkel-Zyklus gehalten.
  2. Am Abend statt Männchen und Weibchen der Zebrafisch-Stamm jj xy: AB / TU; tg (mGFP) in einem Tank mit einem Teiler, um sie voneinander zu trennen. Die Nachkommen dieser Kreuzung wird zum Ausdruck der GFP-Transgen in allen Geweben und wird als Spender verwendet werden. Parallel dazu verwenden die gleiche Prozedur, um Kreuzungen zwischen nicht-transgenen Wildtyp-Tieren. Je nach Zweck dieses Experiments kann man Tiere Wildtyp-Kreuz am jj xy locus als Spender oder Hosts.
  3. Innerhalb einer Stunde nach dem Licht am Morgen dreht, entfernen Sie die Teiler, um die Fische zu paaren können.
  4. Nach 15-30 Minuten sammeln Embryonen in 100 x 15 mm Petrischalen, reinigen Sie sie, und ändern Sie das Medium (Ei Wasser).
  5. Halten Sie die Embryonen in einem 28,5 C Inkubator bis die gewünschte Zeit.
  6. Wenn Sie bereit sind für eine Transplantation, entfernen Sie das Chorion manuell mit zwei Paaren von scharfen Zangen, und inkubieren die Embryonen in 0,2% EDTA in Calcium-freier ZFR für 30 Minuten.

Teil 2: Herstellung von dissection Nadeln

  1. Die Transplantation Verfahren erfordert zwei Arten von Nadeln: eine geschärfte eine, die verwendet werden, um Gewebe um die Linse geschnitten, entfernen Sie das Chorion, und lassen Embryonen aus Agarose ist, und einer stumpfen Nadel verwendet werden, um den Spender Linse bewegen und setzen Sie es in den Host. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Nadeln zu machen.
  2. Zuerst muss die Spitze einer Pasteurpipette abgeschnitten werden mit einer Diamant-Messer. Dann legen Sie eine Glaskapillare in den Pasteur Pipette so dass etwa die Hälfte seiner Länge in ihm ist. Dadurch wird es einfacher, die Wolfram-Draht durch Schmelzen in das Glas in den nächsten Schritt zu immobilisieren.
  3. Dann führen Sie einen dünnen Wolframdraht in das offene Ende der Kapillare. Melt das Glas über den Draht mit einem Bunsenbrenner. Mit einer Pinzette, stabil halten das Glas Ende mit dem Metalldraht, während Drehen Sie das andere Ende der Nadel mit der Hand. Der erweichte Glas sollte spiralförmig um das Metall Greifen Sie ihn.
  4. Wenn Sie eine stumpfe Spitze Nadel sind, dann ist dies das Ende des Verfahrens. So erstellen Sie einen geschärften Nadel, halten Sie die Wolfram-Draht über einem Bunsenbrenner für 1-1.5 Minuten, Abbrennen der Metall so eine sehr feine Spitze entsteht. Prüfen Sie die Qualität der Spitze von microscropy.It ist eine gute Idee, beide Nadeln in die Flamme ein paar Sekunden sofort sterilisieren vor der Transplantation.

Teil 3: Vorbereitung der Reagenzien

  1. Calcium-freie Zebrafisch Ringer (ZFR) Lösungen (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7,2)
  2. 0,2% EDTA in Calcium-freier Zebrafisch Ringer-Lösungen (pH 7,2)
  3. 1,2% Agarose (niedrige Schmelzpunkt) in Calcium-freier ZFR
  4. 0,2% Agarose (niedrige Schmelzpunkt) in Calcium-freier ZFR
  5. Embryo Medium (pH 7,0, pro Liter enthält: 10 ml Hanks Solution # 1, 1 ml Hanks Solution # 2, 10ml Hanks Solution # 4, 10ml Hanks Solution # 5, 0,35 g Natriumbicarbonat, 300 uL von 2M HCl, Penicillin-Streptomycin 500.000 U) wie in der Zebrafisch-Book (University of Oregon Press, 2000).
  6. Tungsten Draht, vergoldet, 0,1 mm Durchmesser, Alfa Aesar
  7. Kapillarrohr, 1,0 mm Durchmesser, World Precision Instruments

Teil 4: Transplantation Verfahren

  1. In einer Kunststoff-Zentrifugenröhrchen, bereiten 1,2% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in Calcium-freier ZFR vorgewärmt auf 40 C in einem Wasserbad.
  2. Bei der gewünschten Stufe (30 hpf, zum Beispiel), nehmen die Embryonen in einer Pasteurpipette langsam zu vertreiben sie in die Zentrifugenröhrchen, und langsam zu vertreiben sie in die Zentrifugenröhrchen und Inkubation für ca. 5 Sekunden. Die Spender und Techniker sollten getrennt inkubiert werden.
  3. Mit einer Pipette nehmen die Embryonen in 1,2% Agarose aus dem Zentrifugenröhrchen und ordnen sie in zwei parallelen Reihen in einem 100mm Polystyrol-Petrischale, halten Wirte und Spender zu trennen. Durch Pipettieren sie langsam und sorgfältig, werden die meisten Embryonen auf ihren Seiten in der Agarose liegen. Sie müssen diejenigen, die nicht in dieser Position liegen, mit der stumpfen Nadel so, dass das Auge nach oben, bevor die Agarose erstarrt neu zu orientieren.
  4. Warten Sie auf die 1,2% Agarose zu verfestigen, und dann überlagern sie mit 0,2% niedrig schmelzenden Agarose-Lösung.
  5. Mit dem geschärften Nadel, entfernen Sie alle Agarose um die Augen, und sehr vorsichtig schneiden Sie die Linse aus dem Host und Spender Embryonen mit kleinen Strichen. Achten Sie darauf, nur nahe genug geschnitten, um das Objektiv, es nicht zu zerreißen, aber auch so nicht zu entfernen zuviel Gewebe aus dem Rest der Host Auge.
  6. Einmal frei, wird Linsen in das Medium schweben. Mit der stumpfen Nadel vorsichtig drücken Sie den SpenderObjektiv bis knapp über den Ort, an dem der Host-Objektiv würde normalerweise, und dann drücken Sie ihn in das Auge mit der stumpfen Nadel. Der Host-Objektiv kann verworfen werden.
  7. Lassen Spender und Wirt Embryonen in 1,2% Agarose für 30-60 Minuten, dann lassen Sie sie von der Agarose mit der spitzen Nadel, und übertragen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit Embryo Medium. Jeder Embryo sollte einen getrennten gut. Achten Sie darauf, in die Vertiefungen richtig, so dass es klar ist, welche Host, mit dem Spender entspricht Etikett.
  8. Inkubieren bei 28,5 C. Der Spender stammenden Linse aus dem Host-Objektiv kann auf der nicht operierten Seite des gleichen Tieres auf GFP-Fluoreszenz unterschieden werden. Die Abschnitte können auch auf die Linse Größe zu messen und festzustellen, ob es richtig differenziert werden.

Abbildung 1
Abb.. 1 Low Vergrößerung Bild eines geschärften Nadel für Objektiv Transplantation verwendet. Eine Glaskapillare (B) wird in die Pasteurpipette (A) eingesetzt und ein dünner Wolframdraht (C) ist in das offene Ende der Kapillare eingesetzt. Das Glas über den Draht wird mit einem Bunsenbrenner aufgeweicht. Mit einer Pinzette, stabil halten das Glas Ende mit dem Metalldraht, während Drehen Sie das andere Ende des Pasteur-Pipette mit der Hand. Der erweichte Glas sollte spiralförmig um die Metall-, Greifen Sie ihn.



Abb.. 2 Die Spitzen der beiden Arten von Nadeln für Objektiv Transplantation verwendet.


Abbildung 3
Abb.. 3 Embryonen unterzog Objektiv Transplantation bei 30hpf. Gezeigt sind ein Spender Embryo (A, B), eine Vielzahl Auge mit transplantierten Linse (C, D), und der Seite der Steuerung des Host-Embryo (E, F). Jedes Auge ist in beiden Durchlicht und UV-Beleuchtung gezeigt, wie angegeben. Die Fotografien wurden bei 48 hpf genommen. Das Q01 [9] transgene Linie wurde in diesem Experiment verwendet.

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Discussion

Mehrere Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit bei der Linse Transplantationen.

  1. Geschärft Nadeln: Es ist besser, mehrere Nadeln vor der Durchführung Objektiv Transplantation vorzubereiten, und die Spitze der Nadeln sind so dünn wie möglich. Eine dickere Nadel reißt mehr Gewebe wegen seiner größeren Durchmesser, so dass ein Ausfall in die Augen zu heilen.
  2. Die Anordnung der Embryonen: Kurz vor der Transplantation müssen die Embryonen Position, so dass sie auf ihren Seiten liegend sind. Bei der Positionierung kann der 1,2% igen härten sehr schnell. Um langsam das Härten von Agarose, kann der Petrischale, indem es in einem 40 ° C Wasserbad schwimmen vorgewärmt werden.
  3. Vor dem Einsetzen des Spenders Linse in den Host-Auge, versuchen, so viel Agarose rund um die Host-Kopf entfernen wie möglich. Es ist einfacher für den Spender Linse, die Art und Weise einzusetzen.
  4. Kurz nach Objektiv Transplantation die Embryonen sollten links eingebettet in der 1,2% igen Schicht durch ein 0,2% Agarose-Schicht abgedeckt werden. Hinzufügen Embryo Medium mit Antibiotika wird die Wundheilung in Geber-und Host-Embryonen zu fördern. Warten Sie 30-60 Minuten vor dem Loslassen Embryonen aus Agarose, und übertragen sie dann in eine 24-Well-Platte mit Embryo Medium.

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Acknowledgements

Dieses Verfahren folgt weitgehend der Transplantation Technik zur Höhle Fische durch das Labor von Bill Jeffrey entwickelt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1mm diameter tungsten wire A Johnson Matthey 45086
Agarose(low melting point) Sigma-Aldrich 39346
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-4
Forceps Dumont 11252-30
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette pump Fisher Scientific 13-683C
Petri Dish Cardinal Health D1906
Penicillin-streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140-122

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References

  1. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
  2. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
  3. Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
  4. Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344, (4), 532-542 (1994).
  5. Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23, (11), 531-541 (2000).
  6. Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42, (4), 527-533 (2002).
  7. Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
  8. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
  9. Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).

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