Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

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Summary

Selection, Mikroinjektion, und Bildgebung von fluoreszenzmarkierten F-Aktin über fluoreszierende Speckle-Mikroskopie (FSM).

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Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).

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Abstract

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM), um hochauflösende Bilder der Aktindynamik in PtK1 Zellen zu erfassen. Ein einzigartiger Vorteil der FSM ist seine Fähigkeit, die Bewegung und Umsatz Kinetik (Montage / Demontage) der F-Aktin-Netzwerk innerhalb lebender Zellen zu erfassen. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Ermittlung quantitativer Messungen von F-Aktin-Dynamik, wenn sie mit Computer-Vision-Software (qFSM) gepaart. Wir beschreiben die Auswahl, die Mikroinjektion und Visualisierung von Fluoreszenz-Aktin-Sonden in lebenden Zellen. Wichtig ist, dass ähnliche Verfahren für die Visualisierung von anderen macomolecular Baugruppen. FSM hat für Mikrotubuli, Intermediärfilamente und Haftung Komplexe nachgewiesen.

Protocol

Abschnitt 1: Beziehen Sie Ihre fluoreszenzmarkierten Aktin für FSM

Benötigte Materialien: gereinigtem Aktin, Fluorophor (Alexa, X-Rhodamin empfohlen). G-Puffer, Ultrazentrifuge

  1. Eine wichtige Komponente für den Erwerb guter FSM Filme erfordert die korrekte Kennzeichnung von Aktin (oder andere Zytoskelettproteine) mit dem Fluorophor Ihrer Wahl.
    Wir empfehlen die Verwendung von Fluorophoren Alexa (488, 568 Wellenlängen) und X-Rhodamin Succinimidylester Derivate, die Lysinreste ausgesetzt Ziel auf der Oberfläche von Aktin.
  2. Bei der Wahl Ihres Fluorophor und seiner entsprechenden Wellenlänge, sicherzustellen, dass Ihr Mikroskop Setup die entsprechenden Filter (Anregung und Emission) und Beleuchtungen hat (Quecksilberdampf-Lampe und / oder Laser), um Ihre Fluoreszenz-Tag unterbringen. Wir empfehlen die Auswahl Wellenlängen im orange bis roten Wellenlängen (560-630 nm), um die Auswirkungen der Auto-Fluoreszenz-und Foto-Schäden zu minimieren und auf ihre Vereinbarkeit mit GFP-Konjugate zu gewährleisten.
  3. Reine Aktin aus Muskelgewebe Zugehörigkeit zu Rat oder Huhn extrahiert werden, sondern erfordert eine langwierige Extraktion von Muskel-Aceton-Pulver. Muscle Aceton-Pulver kann von Invitrogen erworben werden. Die Kennzeichnung Verfahren ist noch nicht in diesem Protokoll diskutiert, aber finden Sie hier [1] zu finden
  4. Alternativ können Sie markierte Aktin-Proteinen aus mehreren Anbietern, darunter Zytoskelett Inc. und Invitrogen kaufen. Benutzerdefinierte Beschriftung Dienstleistungen werden auch von Invitrogen zur Verfügung. Gereinigtes, nicht-markierten Aktin (beide Muskel-und nonmuscle Aktin) kann von Zytoskelett Inc. erworben werden
  5. Ob zum Kauf oder bereiten Sie Ihre eigenen markiertes Aktin entscheiden, wollen Sie sicherstellen, dass die Kennzeichnung Verhältnis irgendwo um 0,3 bis 0,7 Farbstoffe pro Monomer von Aktin. Eine zu hohe Markierungsverhältnis kann Auswirkungen auf die Umsatz-Kinetik (und die Bindung an assoziierten Proteinen) des Aktin-Filamenten, während eine zu niedrige Kennzeichnung Verhältnis zu arm aussehende Flecken (niedrige Signal-Rausch-) führen wird und kann Mikroinjektion Probleme (siehe unten) führen. Dies ist ein entscheidender Faktor, um gute Specklebilder.
  6. Vor längerer Lagerung sollten die markierten Aktin-Lösung durch das Drehen mit 75.000 geklärt werden - 80.000 xg für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Markiertes Aktin sollte in G-Puffer gespeichert und aufbewahrt -80 Grad Celsius. Herstellung von 2 uL Aliquots wird dringend empfohlen, die schädlichen Wirkungen von wiederholtes Einfrieren und Auftauen (führt zu unlöslichen Aggregaten) zu reduzieren. Refrain aus Freilegung der markierten Aktin-Lösung für direktes Licht (wird von Fluorophoren Bleichen). Wir empfehlen die Verwendung undurchsichtige Reaktionsgefäße für die langfristige Lagerung.

§ 2: Herstellung von Zellen und Mikroinjektion von markiertem Aktin

Benötigte Materialien: Mikroinjektion Nadeln, Mikroliterspritze microloaders, vorgewärmt Zelle Medien, Injektionspuffer, Eimer mit Eis, Mikroskop (Phase Ring, Phasenkontrast Objektiv 40x, transjector-, Nadel-Abzieher, Mikromanipulator)

  1. Viele Zelltypen sind zugänglich für FSM, aber immer gute Specklebilder ist direkt abhängig von dem Erfolg der Mikroinjektion Verfahren. Bei der Auswahl der Zellen für die FSM, Zellen sollte groß (> 50 um im Durchmesser), sollte verbreitet, wenn vernickelt, und natürlich Anhänger auf Substrate (oder Kunststoff Gewebekulturschalen). Es hilft auch, wenn die Zelle Cytosol nimmt eine Fläche größer als sein Kern. Die oben genannten Kriterien zu gewährleisten, dass die Zellen zugänglich Mikroinjektion werden. Erfolgreiche Kandidaten Zelllinien umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) PtK1 [2,3], newt Lungenzellen [4], und Aplysia [3].
  2. , Die mit Säure gewaschen haben; Cells sollten auf Platz Deckgläser (. Keine 1-1/2 22 x 22 mm) beschichtet werden. Standard-Substrat Beschichtung kann auf das Deckglas aufgetragen werden und wirken sich nicht auf die Mikroinjektion.
  3. Die richtige Auswahl der Mikroinjektion Nadeln ist abhängig von der Größe der Spitze öffnen. In der Regel können Lochgrößen sehr in der Größe von 0,5 um bis so groß wie 3 um. Wir empfehlen jedoch, dass die Injektion von Aktin erfordert eine optimale Öffnung der Größe zwischen 0,5 bis 1 um. Wenn Verstopfung Probleme konsequent auftreten, können größere Loch Größen für die Lieferung von monomeren sowie unerwünschte polymerisiert Aktin-Filamenten unterzubringen. Mikroinjektion Nadeln können durch mehrere Anbieter wie Eppendorf Systeme, die femtotip Mikroinjektion Nadeln machen erworben werden. Alternativ, wenn eine kommerzielle Nadel Abzieher vorhanden ist, kann Glas Mikroinjektion Rohre von Sutter gekauft und zog nach Spezifikation. Für Anfänger empfehlen wir mit 10-20 gezogen Nadeln auf der Hand vor dem Beginn der Injektion.
  4. Ideal 'Injektion Konzentration "(Endkonzentration von Aktin in Ihre Nadel geladen) von Aktin liegt zwischen 0,5 bis 1,0 ug / ul auf Basis eines 40% Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer. Lower Kennzeichnung Verhältnis Ihrer Aktin kann durch die Injektion bei höheren Konzentrationen (1-3 ug / ul) kompensiert werden. Allerdings wird die Verstopfung Frequenz Ihrer Nadelerhöht werden. Dies kann teilweise durch Verwendung von Nadeln mit größeren Öffnungen gelindert werden. Lager-Konzentration von Aktin kann durch Zugabe von eiskaltem Injektion verdünnt werden. Eiskalte ddH2O kann auch verwendet werden, um schnelle Injektionen zu verdünnen. Zu diesem Zeitpunkt arbeiten alle Lösungen sollten auf Eis gehalten werden.
  5. Last von 0,5 bis 1,0 uL Ihrer Aktin-Lösung mit einer Mikroliterspritze (Schmalspurbahn - Hamilton), oder alternativ mit einem Microloader Pipettenspitze.
  6. Sorgfältig verzichten die Aktin-Lösung, durch leichtes Lösen der Lösung. Bubbles sollte vermieden werden, kann aber leicht durch die Aufnahme überschüssiger Flüssigkeit um die Blase entfernt werden.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Aktin-Lösung ist komplett Ruhe an der Nadelspitze. Überschüssige Lösung überall entlang der Kapillare der Nadel kann stören die Einspritzmenge.
  8. Nun vorsichtig die Nadel legen, Vermeidung von Kontakt mit der Nadelspitze, um den Injektor Inhaber. Positionieren Sie die Halterung, so dass die Nadel macht 35-50 Grad-Winkel an der Basis des Mikroskoptisches. Lower Winkel sind bevorzugt.
  9. Senken Sie die Spitze der Nadel, bis er bricht kaum die Oberfläche der Medien baden Ihre Zellen.
  10. Jetzt Position der Nadelspitze (ohne Tieferlegung), so dass es direkt über dem Mittelpunkt des Ziels liegt. Wenn die Nadelspitze mit dem Ziel ausgerichtet ist, sollten Sie einen hellen Schein durch das Okular zu sehen. Dies ist das Ende der Nadelspitze. Langsam bewegt die Nadel hin und her (mit dem Manipulator) können besser helfen suchen Sie den Heiligenschein.
  11. Stellen Sie die z-Fokus auf das Mikroskop, bis Ihre Zellen in klare Sicht sind. Nun, langsam wieder die Spitze, bis die Halo allmählich verengt, bis schließlich konvergieren in der Nadelspitze - Sie benötigen, um den Fokus (z-Position) gleichzeitig zu steuern. Ein zusätzliches Feature zu suchen ist die Welle der Nadel, die lineare Schatten werfen wird. Senken Sie die Nadel wird nach und nach Definition der Nadelschaft. Bei richtiger Ende der Nadel und Ihre Zellen getan werden sollte, sowohl in klar sehen zu können. Leichte Einstellung der Phase-Ring erforderlich, um den Kontrast zu verbessern.
  12. Bei der Navigation, sicherzustellen, dass die Nadelspitze ist weit über Ihre Zellen zu verhindern Bruch der Nadelspitze.
  13. Bei der Auswahl der Zellen zu injizieren, sollten die Zellen mit freien Kanten werden vor der Nadelspitze. Dadurch wird sichergestellt, sinkende Steigung der Zelle (aus dicksten Stelle, wo der Kern liegt, um die dünnste Stelle der Vorderkante) wird die Nadelspitze, anstatt parallel zu ihr gerecht zu werden.
  14. Die Nadel Druck sollte bei 0,3 bis 0,8 bar eingestellt werden. Der konstante Druck wird in einem stetigen Fluss des Aktin-Lösung führen.
  15. Nach der Entscheidung über eine Zelle zu injizieren, positionieren Sie Ihren Nadel so die Spitze befindet sich neben dem Kern (perinukleären Region, dickste Teil der Zelle, wo der Kern ist nicht direkt unten).
  16. Langsam senken, und justieren die Position der Nadel, bis die Spitze ist deprimierend die Membran, nun schrittweise abzusenken, bis die Nadelspitze die Membran durchstochen hat. Wenn die Nadel vollständig die Membran durchstochen, wird die Zelle heller erscheinen, sobald Sie sehen diesen Unterschied Heben Sie die Nadel, bis es nicht mehr berührt die Zelle. Die eigentliche Piercing und Injizieren Vorgang dauert 0,5 bis 2 Sekunden.
  17. Wenn es richtig gemacht, wird die Zelle Form erscheinen unverändert, während zu viel Injektion in schnelle Zurückziehen der Zelle Rand führen wird und in einigen Fällen werden Sie tatsächlich sehen, die Zelle explodiert.
  18. Wenn Sie nicht sehen, Veränderungen in der Zelle, wenn Mikroinjektion (nicht heller), kann die Nadelspitze geschlossen werden. Sie können diese durch Drücken der "sauberen"-Taste, wenn auf Ihrem transjector testen. Wenn geöffnet ist, wird dies deutlich erhöhen den konstanten Druck Strömung, die durch die Okulare sehen kann - es erscheint wie Wellen und in der Nähe Trümmer zu sehen Dispergieren werden.
  19. Wenn die Nadelspitze geschlossen ist, können Sie wählen, um eine neue Mikroinjektionsnadel oder versuchen, die Spitze der Nadel durch leichtes Absenken der Nadel, bis die Spitze der Nadel drückt gegen die Deckglas einfügen, wodurch die ganz am Ende der Spitze zu brechen. Der Bruch Bereich sollte nicht mehr als ein 1 / 5 th der Bereich der Nadelspitze (der Teil der Nadel, die an einem Punkt zusammenlaufen beginnt).
  20. Fahren Sie mit der Injektion, nicht mehr als 20 bis 45 Minuten pro Sitzung Mikroinjektion (wird vom Zelltyp abhängig). In der Regel sind kürzere Sitzungen empfohlen, Stress auf die Zellen zu minimieren.
  21. Nach Beendigung der Mikroinjektion, ändern Sie die Zelle Medien in der Schale durch Zugabe von frischem vorgewärmten Medien. Dann können Zellen für 30 Minuten in einem Inkubator vor Sicherung wiederherstellen. Dies ermöglicht auch für die Aktin-Zytoskelett in das bestehende Netzwerk zu integrieren.

Abschnitt 3: Zusammenbau des Imaging Chamber

Benötigte Materialien: Deckglas, doppelseitiges Klebeband, Q-Tips, Pinzetten, valap, kim wischen, Oxyrase, Bildmedien, Rasierklinge, p200 piPette, reines Ethanol

  1. Beginnen Sie mit dem Vorwärmen der Bildmedien und Auftauen von 15 uL Aliquot Oxyrase. Achten Sie auf die lichtempfindliche Oxyrase vor Licht zu schützen. Die Zugabe von Oxyrase wird erheblich reduziert die Auswirkungen von Ausbleichen.
  2. Vorwärmen valap, indem die Temperatur der Heizplatte zu gering. Nicht überhitzen / brennen valap es seine Wirksamkeit als Dichtstoff wird verlieren.
  3. Wischen Sie den Knopf A Deckglas mit einem Kimwipe mit reinem Ethanol übergossen zu reinigen und zu entfernen kleine Trümmer.
  4. Stack zwei gleich große Längen (2,5 cm lang) von doppelseitigem Klebeband auf der jeweils anderen, mit einem sauberen, ebenen Untergrund als Plattform. Drücken Sie eventuell eingeschlossene Luftblasen zu einer völlig flachen Ebene zu schaffen.
  5. Mit einer Rasierklinge geschnitten zwei geraden Streifen entlang der Längsachse, so dass jeder Streifen 0,5 cm in der Breite misst.
  6. Mit einer Pinzette, statt jedes Streifens an die lange Kante des Deckglas, so dass die zwei Streifen Klebeband eine Lücke in der Mitte Ihres Deckglas schafft. Drücken Sie vorsichtig auf das Band zu einem schönen Siegel mit dem Glas zu machen. Der Klebestreifen wird als Abstandshalter zwischen den Deckglas und dem Deckglas zu handeln.
  7. Sicherstellen, dass die valap vollständig verflüssigt, bevor Sie den nächsten Schritt zu beginnen.
  8. Rufen Sie Ihre vorgewärmten Bildmedien, Zugabe von 15 ul Oxyrase um alle 500 uL der Medien.
  9. Falten Sie Kimwipes in Dreiecke zu erstellen 3 harte Kanten. Dies wird verwendet, um eine trockene Oberfläche für die Band zu schaffen, um auf dem Stick werden.
  10. Rufen Sie Ihre Zellen aus dem Inkubator. Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen Ecke des Deckglases. Schnell Ort das Deckglas auf einem Kimwipe (cell Seite nach oben zeigt, nicht das Gewebe zu berühren), und verwenden Sie das gefaltete Kimwipe auf zwei gegenüberliegenden Seiten des Deckglases wischen, um einen halbtrockenen Oberfläche zu erzeugen (auf der Oberfläche, wo Ihre Zellen rest).
  11. Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen Ecke des Deckglases und legen Sie es auf Ihrem Deckglas, so dass die trockenen Oberflächen, die beiden Klebestreifen ausgerichtet sind. Beachten Sie, jetzt haben Sie zwei geschlossene Seiten und zwei offene Schlitze. Langsam Pipette 200 ul Ihre Imaging-media-Oxyrase Lösung nahe einer Öffnung. Wichtig ist, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Die Lösung sollte bis in den neu zusammengestellten Kammer durch Kapillarkräfte gesaugt werden, damit voll Eintauchen Ihre Zellen in Lösung.
  12. Mit einem Q-Tip dab die vier Ecken des Deckglases mit zerlassener valap schnell anbringen und Stabilisierung des Deckglas. Sie werden bemerken, dass die valap trocknet sofort (innerhalb von Sekunden bei Raumtemperatur).
  13. Nun beginnt mit den offenen Seiten (non-Band auf dieser Seite), lag ein dünner Streifen valap mit einem Q-Tip und imitiert ein Bürsten Schlaganfall. Wiederholen Sie dies für den geschlossenen Seiten. Langsam bauen den Mantel des valap, stärkt damit die Dichtung durch die Wiederholung der Beschichtung Schritte. Die valap sollte, um die Kanten zu beschränken, so dass die Mitte des Deckglases klar.
  14. Reinigen Sie das Mittelteil des Deckglases mit einem Q-Tip mit ddH2O um restliche Medien zu entfernen, wobei darauf bedacht, nicht in die Zellen zu vernichten. Wiederholen Sie die Reinigung mit reinem Ethanol.
  15. Sie haben jetzt ein vollständig geschlossenes Bildgebung Kammer für Speckle-Imaging optimiert. Mit einem vollständig geschlossenen Gehäuse wird Ihr Fluorophore aus schnell Ausbleichen zu verhindern.

Abschnitt 4: Imaging-Zellen

Benötigte Materialien: invertiert Weitfeld Mikroskop Mecury Lampe, entsprechende Filter, gekühlte CCD-Kamera mit 6,7 Mikron-Pixel, hohe numerische Apertur, Öl-Immersions-Plan-Apochromat Objektive (60x bis 100x, Phase oder DIC). Vibration Tisch. Imaging-Software.

  1. Vorwärmen des Mikroskoptisches bis 37 Grad. Zeigen Sie mit der neu abgeschlossenen Bildgebung Kammer, und warten Sie 10-15 Minuten für die Temperatur, bevor Bildgebung zu stabilisieren.
  2. Beginnen Sie mit der Fokussierung Ihre Zellen in Hellfeld-, und dann finden Sie Ihre injizierten Zellen durch Umschalten der richtigen Fluoreszenz-Einstellungen. Versuchen Sie, die Zeit der Fluoreszenz Exposition zu verringern Ausbleichen zu minimieren.
  3. Suchen Sie nach injizierten Zellen, die gesunde gekrümmte Kanten haben. Over-injizierten Zellen (explodierte Zellen) wird zurückgezogen und gezackte Ränder charakterisiert werden, ähnlich wie zahlreiche Filopodien - vermeiden Bildgebung dieser Zellen.
  4. Acquisition Einstellungen werden auf dem Zelltyp, die Qualität der markierten Aktin-und Mikroskop-Komponenten ab. Allerdings sollten die Belichtungseinstellungen nicht größer als 2 Sekunden, und das Zeitintervall zwischen den Bildern sollte zwischen 5 und 10 Sekunden eingestellt werden. Typische Längen für eine Zeitreihe (pro abgebildet Zelle) kann irgendwo zwischen 10 bis 30 Minuten betragen und wird durch Bleichen Effekte begrenzt. Gain-Einstellungen an der Kamera kann bis eingeschaltet werden, um das Signal-Rausch zu steigern.
  5. Ideal Speckle-Eigenschaften sollte Speckle-Durchmesser auf den nächsten benachbarten Speckle jeweils ~ 2 Speckle-Abstand. Dies wird gewährleistet eine optimale räumliche und zeitliche Abtasten der Aktin-Struktur. Für Epithelzellen, die gesprenkelten Aktin-Netzwerk homogen erscheinen, mit Flecken gleichmäßig auseinander. Zelllinien, die dichte Stress Fasern oder Lamellipodien Funktionwird unterscheidbar sein, sondern eine punktierte / gesprenkelte Aussehen haben. Exposure-Einstellungen sollten angepasst werden, um die besten gesprenkelt Bilder zu bekommen.
  6. Over-mikroinjiziert Zellen müssen dicht gepackt Sprenkel, die nicht angezeigt werden diskret. Stress-Fasern und die Lamellipodien verliert seine gepunktete Aussehen.
  7. Under-mikroinjiziert Zellen erscheint sehr dunkel durch das Okular, mit Sprenkeln, die weit voneinander entfernt sind (> 10 Sprenkel auseinander) und erscheinen nach dem Zufallsprinzip verteilt. Stress-Fasern und die Lamellipodien in diesen Zellen werden ununterscheidbar.
  8. Key zu erhalten, "gut" Speckle-Filmen ist die Aufrechterhaltung konzentrieren. Dies ist besonders wichtig für die post-Analyse mit Speckle-Flow und Umsatz-Messungen. Dadurch wird die Qualität der quantitativen Analyse wird zum Sperren in den Fokus für die Dauer der Zeitraffer-abhängig. Dies kann besonders anspruchsvoll, wenn die Bildebene ist ziemlich dünn. Andere Faktoren, auf die Stabilität des Mikroskop-System, insbesondere die Bühne Gehäuse und der bildgebenden Kammer ab. Kontrast-basierten Fokussierung kann verwendet werden, wenn Bild-Intervall Länge ausreicht, um diese Funktion unterbringen werden. Weitere Optionen sind den Kauf eines Nah-Infrarot-basierte Fokus-System, das zuverlässige Echtzeit-Fokuseinstellungen bietet. Sie können diese Angebote von Nikon, Olympus und ASI zu finden.

Abschnitt 5: qFSM Analyse

Dieser Abschnitt ist nicht im Detail diskutiert, aber die Informationen über die Analyse-Software finden Sie hier [5] zu finden. Software Download-Anfragen finden Sie auf unserer Website (lccb.scripps.edu) vorgenommen werden.

Behandelte Themen:

  • Lärm-Kalibrierung
  • Speckle-Erkennung
  • Tracking mit einem hybriden Ansatz der Bildkorrelation-basiertes Tracking der groben Bewegung Speckle-Gebiete und einzelne Partikel-Tracking der detaillierten Bewegung einzelner Flecken.
  • Die Berechnung der Polymer-und Abbau Preise aus dem Intensitätsschwankungen während Speckle Erscheinen und Verschwinden Veranstaltungen.

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Discussion

Mehrere wichtige Faktoren sind entscheidend für die erfolgreiche Bilder Speckle erhalten, beginnen aber gute Speckles und enden mit der Qualität Ihrer fluoreszenzmarkierten Aktin. Ein hoher Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer, um 0,4 bis 0,7 eingestellt wird sichergestellt, dass Flecken erscheinen hell und diskret, während das markierte Protein selbst sollte löslich und frei von Aggregaten. Ebenso wichtig ist die Mikroinjektion Verfahren. Um normalen Zell-Homöostase (und Überleben), müssen Zellen mit einer geringen Fließdruck injiziert werden, die Einführung einer geringen Konzentration an markiertem Protein. Dies erfordert ein gewisses Maß an technischer Kompetenz / Erfahrung in Bezug auf die Nutzung der Mikroinjektion System. Als allgemeine Regel gilt, kürzere Einspritzzeiten (<1s) über längere Einspritzzeiten bevorzugt. Der letzte entscheidende Komponente ist das Mikroskop. Eine inverse Mikroskop mit einer Quecksilber-Lampe epi-Hilfslicht, in den meisten Core Facilities gefunden gepaart, wird als eine geeignete Plattform für die Speckle-Imaging dienen. Vorausgesetzt, die richtige Fluoreszenz-Filter sind vorhanden, die Kombination einer hohen NA objektive und eine gekühlte CCD-Kamera wird Bilder mit hoher Auflösung von hellen Flecken zu produzieren. Wir empfehlen die Verwendung hoher Vergrößerung (100x), hohe NA (> 1,3), Plan-Apochromat Ziele, die hohe Auflösung und Helligkeit sorgen wird. Unter idealen Bedingungen Injektion, können Sie die Vergrößerung auf 60x gesenkt werden, wodurch die Helligkeit und SNR pro Pixel. Geringes Rauschen, hohe Quanten-Effizienz, gekühlte CCD-Kameras, mit Pixel-Größen von ~ 6,5 Mikrometer sind ideal Detektoren, und in einigen Fällen kann für schlechte Qualität Fluoreszenzsonden kompensieren. Darüber hinaus können fluoreszenzmarkierte Protein-Proben mit cDNA-Konstrukten (nucleoinjection) zum Ausdruck zu bringen GFP / RFP konjugierte Proteine ​​innerhalb der gleichen Zelle co-injiziert werden. Dies erfordert die nucleoinjection der cDNA in den Kernen der Zellen, von einer zweiten Injektion in das umgebende Zytoplasma gefolgt. Zusammenfassend bietet FSM beispiellose Einblicke in Zytoskelett Dynamik. Erzielung einer guten Sprenkel erfordert die richtige Sonden, die Ausrüstung und ein wenig Geduld (Training).

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Acknowledgments

Die Entwicklung der qFSM wird durch die NIH U01 GM06230 finanziert.

Materials

Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C

G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercapt–thanol

Store up to 1 day at 4° C

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References

  1. Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
  2. Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
  3. Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
  4. Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
  5. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).

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