Author Produced

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

이 비디오에서는 소개

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

CD40 - 활성화된 B 세포는 (CD40 - B 세포) 단백질 stimulatory 항원 제시 암 immunotherapy에 대한 세포 (APC하는) 1-3의 대체 소스로 확인되었습니다. CD40 - B 세포가 여러 가지 서로 다른 생물 학적 및 기술적 특성을 가지고 돌기 세포 (DCS), 최고의 특징 APC, 비교. DC가 마찬가지로, B 세포는 MHC와 공동 stimulatory 분자 (Fig.1b)의 증가 표현을 표시, 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극 후 강력한 철새 용량과 효율적인 T 세포에 존재 항원 프레 젠 테이션을 나타냅니다. 그러나, 미숙 또는 성숙 DC가와는 대조적으로, CD40 - B 세포는 CD62L, CCR7/CXCR4 이루어진 전체 림프절 유도 깡패을 표현하고, 보조 림프 기관으로 유도하기 위해 필요한 백혈구 기능 항원 - 1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3. CD40 - B 세포는 더욱 높은 순수 CD40 - B 세포를 건강한 기증자로부터 (> 10 9 환자 당 세포)뿐만 아니라 암 매우 다량으로 체외로 확장시킬 수 말초혈 매우 소량의 어려움없이 생성할 수 있습니다 환자 (Fig.1c, D) 1,4.

이 프로토콜에서 우리는 인간의 PBMC에서 완벽하게 작동 CD40 - B 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 세포 배양을위한 주요 분자는 CD40 리간드, 인터루킨 -4 (IL - 4) 및 시클 로스 포린 A (CSA), 3~4일 문화주기에 보충함하는. 아르 실험 목적 CD40 - 자극은 재조합 인간 CD40 리간드 (tCD40L NIH/3T3) 5을 표현 NIH/3T3 세포에 의해 제공됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에있는 인간 CD40 리간드 표현 (Fig.2) 정기적으로 확인되어야한다.

십사일 후 CD40 - B 세포 배양 이상 순도 95 프로지 B 세포 65 일 동안 CD40 - B 세포의 확장 기능을 1, 4의 손실없이 자주이 가능합니다 구성되어 있습니다. CD40 - B 세포가 효율적으로 프로세스를 차지하고 T 세포에 항원 제시 6. 그들은 소수 naϊve 모르지만, 또한 메모리 T 세포에게 7,8를 확장합니다. CD40 - 활성화된 B 세포는 B - 세포 활성화, 차별과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 예방 접종을위한 유망한 도구를 나타냅니다.

Protocol

PBMC에서 인간 CD40 - 활성 B 세포의 생성에 대한 프로토콜은 두 부분으로 나뉘어져 있습니다 : 제 플레이트 - 바운드 피더 세포로 사용됩니다 NIH/3T3 세포를 표현 CD40 리간드의 준비를 보여줍니다. 파트 B는 실제 CD40 - B 문화를 설명합니다.

피더 세포의 A. 준비 (tCD40L NIH/3T3)

tCD40L NIH/3T3 완전히 합류가해서는 안 자기편 murine fibroblast 세포 라인입니다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다.

  1. 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음.
  2. 37 5-10분에 75cm 2 플라스크 4 ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다.
  3. 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 부드럽게 회전.
  4. 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운.
  5. 뜨는을 제거하고 야생 유형 매체 10 ML에서 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 카운트하고 세포의 적절한 수의 세 50 ML 튜브를 준비 :
    1. subculturing에 대한 1.5 X 10 6 세포
    2. 0.2 X 10 6 세포 / 잘 CD40 - B 세포 배양에 사용되는 방사선에 대한
    3. 프리즈에 나머지 (필요한 경우).
  6. 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운.
  7. 뜨는을 제거합니다.
    1. subculturing 들면 : resuspend 1.5 75cm 2 세포 배양 플라스크 10 ML 야생 유형 매체 (세포 밀도가 1.5 X 10 5 셀 / ML)에서 X 10 6 세포, G - 418을 추가 [0.7 MG / ML]와에있는 세포를 품어 5% CO 2와 37 ° C. 두 당 주 세포를 분리.
    2. CD40 - B 세포 배양의 경우 : 한 6 자 접시 1.2 X 10 6 세포가 필요합니다. 0.1 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 야생 유형의 매체에있는 세포를 Resuspend하고 78 쥐에서 그들을 비추다. 물론 각 37에서 그들을 품어 ° C와 5 % CO 2에 세포 현탁액의 플레이트 2 ML. tCD40L NIH/3T3 세포가 자기편 때 B - 세포 자극이 준비한 접시를 사용합니다 (최소한 4 시간 : 현미경으로 준수를 확인, B - 세포 자극을 시작하는 이상 24 H를 기다리지 않는다). (B. 계속)

B. CD 40의 B 세포 배양

CD40 - 자극 (일 공)에 대한 PBMCs의 I. 준비 :

주의 : 당신이 피더 세포가 자기편 것을 확인할 계속하기 전에. 항상 인터루킨 - 4 및 시클 로스 포린의 성장 매체 바로 사용하기 전에 새로운 솔루션을 추가합니다.

  1. 신선한 또는 적절하게 해동 중 하나를 PBMCs 가져가라. Resuspend 그들을 씻고 7 분 및 기타 세포를 제거 7 분 190 XG에서 두 번째 시간에 265 XG에 처음 스핀 다운을 1X PBS의 50mL 두 번 PBMCs. 뜨는을 취소하고 PBS 20 ML에있는 세포를 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 확인합니다.
  2. 5 분 225 XG에서 세포의 필요한 양을 스핀 다운. 6 잘 플레이트 4 X 10 6 세포 / 잘 따라서 판 당 24 X 10 6 셀 필요합니다.
  3. 뜨는를 제거하고 성장 요인 및 0.63 μg / ML 시클 로스 포린과 같은 A는 T - 세포의 파생물을 방지하기 위해 갓 50 U / 인터루킨 - 4의 ML과 보충 CD40 - B 문화 매체 1 X 10 6 세포 / ML에서 PBMC를 resuspend (감안할 때 농도가 한 ML 문화 매체를 참조!).
  4. 에서 뜨는을 제거 6 잘 플레이트 사전 incubated tCD40L NIH/3T3 세포와 함께.
  5. 2 ML PBS마다 잘 첫번째와 CD40 - B 세척 매체 2 ML과 함께 두 번째 단계에서 자기편 tCD40L NIH/3T3 세포를 씻으십시오.
  6. 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 잘하는 PBMC 정지 4 ML (1 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다.
  7. 37 세포를 품어 ° C와 5 % CO 2.
  8. 일 7.2에서 세포 (3.2 계속.) reculture.

II. CD40 - B 세포 (일 7 다음 모든 3~4일)의 Recultivati​​on :

  1. 50 ML 튜브에 10 ML의 피펫과 수영장 그들과 함께 resuspending하여 6 - 잘 접시에서 CD40 - B 세포의 수확 클러스터.
  2. 7분에 대한 225 XG에 스핀 다운 및 완전히 CD40 - B 세척 매체로 뜨는 교체하십시오. 나누어지는의 세포 금액을 계산하는 동안, 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운. 1 X 10 6 세포 / ML의 농도에서 CD40 - B 문화 매체 Resuspend CD40 - B 세포.
  3. 50 U / ML의 농도와 매체 0.63 μg / ML 시클 로스 포린의 인터루킨 - 4의 새로운 솔루션을 추가합니다.
  4. 6 잘 플레이트 tCD40L NIH/3T3 세포 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다.
  5. 2 ML PBS마다 잘 첫번째와 CD40 - B 세척 매체 2 ML과 함께 두 번째 단계에서 자기편 세포를 씻으십시오.
  6. 6 세포 / ML)를 추가합니다.
  7. 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2.
  8. Subculture 세포가 다시 모든 3-4일 14 일 총 후에 고도로 순수한 인간 CD40 - B 세포 활성화와 최종 수 있습니다.

C.의 문제 해결 - 뭐 CD40 - B 세포 성장하지 않으면?

  1. 당신은 피더 세포의 CD40 리간드 발현에 대한 검사 있습니까?
  2. 판 - 바운드 자극에 사용되는 피더 세포는 24 시간 이상은 안하나요?
  3. mycoplasma 수있는 오염인가?
  4. 보완을 위해 사용되는 인터루킨 - 4 솔루션은 갓 해동하고 적절한 생물 학적 활동을했다나요?
  5. 시클 로스 포린 A는 정확한 농도에 추가습니까?

그림 1
그림 1. 주시기 바랍니다 여기를 클릭하세요 그림 1의 더 큰 버전을 위해.

그림 2
그림 2.하세요 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 위해.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics