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ヒトCD40活性化B細胞の生成

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

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Abstract

CD40活性化B細胞(CD40 - B細胞)癌免疫療法1-3免疫刺激抗原提示細胞(APC)の代替源として同定されている。樹状細胞(DC)、最も特徴的なAPCに比べて、CD40 - B細胞は、いくつかの異なる生物学的および技術的な性質を持っている。樹状細胞と同様に、B細胞はMHCと共刺激分子(図1b)の発現増加を示す、インターロイキン4およびCD40リガンド(CD40L)による刺激の後、強い遊走能と効率的にT細胞に存在する抗原提示を示す。しかし、未成熟または成熟DCとは対照的に、CD40 - B細胞はCD62L、CCR7/CXCR4から成る完全なリンパ節ホーミングトライアドを表現し、二次リンパ器官へのホーミングに必要な白血球機能抗原-1(LFA1、CD11a/CD18)、 (図1A)3。 CD40 - B細胞は、さらに高純度のCD40 - B健康なドナーからの細胞(患者あたり> 10 9細胞)だけでなく、癌の非常に大量にin vitroで拡張することができる末梢血中の非常に少量から困難なしで生成することができます。患者(Fig.1c、D)1,4。

このプロトコルでは、ヒトPBMCから完全に活性化されたCD40 - B細胞を取得する方法を示します。細胞培養のための重要な分子は、CD40リガンド、インターロイキン-4(IL - 4)とシクロス​​ポリン(CSA)、3〜4日の文化のサイクルで補充されている。です。実験の目的のためにCD40刺激は、組換えヒトCD40リガンドを発現NIH/3T3細胞(tCD40L NIH/3T3)5によって提供されます。非トランスフェクト細胞の混入を避けるために、トランスフェクタントでヒトCD40リガンドの発現は、(図2)定期的にチェックする必要があります。

14日後にCD40 - B細胞の培養は、65日間にわたって95%以上の純粋なB細胞とCD40 - B細胞の増殖から構成されて関数1、4のいずれかを失うことなく頻繁に可能です。 CD40 - B細胞は、効率的に、プロセスを占有し、T細胞に存在する抗原6。彼らだけでなく、素数ナイーブを行うだけでなく、7,8メモリーT細胞を展開します。 CD40活性化B細胞はB細胞の活性化、分化と機能を研究するために使用することができます。また、彼らは腫瘍9に対する治療または予防接種のための有望なツールを表しています。

Protocol

パートプレート結合フィーダー細胞として使用されるNIH/3T3細胞を発現するCD40リガンドの準備を示しています:PBMCからヒトCD40活性化B細胞を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています。パートBは、実際のCD40 - Bの文化を説明します。

フィーダー細胞のA.準備(tCD40L NIH/3T3)

tCD40L NIH/3T3は完全にコンフルエントになることはありません接着マウス繊維芽細胞株、です。細胞は、そのため1週間に2回分かれています。以上の6週間以上の培養が推奨されていません。

  1. 滅菌ピペットを用いて初代培養から古い培地を除去し、1 × PBS 10 mLで細胞を洗浄。洗浄後PBSを吸引除去する。
  2. 37℃で5-10分は75 cm 2のフラスコに4 mLのトリプシン/ EDTAを追加℃に細胞を分離するために穏やかなタッピングを使用してください。
  3. 野生型の培地10mLを加え、穏やかに回転さ。
  4. 滅菌ピペットで50mLのチューブに細胞懸濁液を移し、5分間、225 × gで細胞をスピンダウン。
  5. 上清を除去し、野生型の培地10mLにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液のアリコートの細胞数をカウントし、適切な数の細胞を3つの50 mLの試験管を準備します。
    1. 継代のための1.5 × 10 6細胞
    2. 0.2 × 10 6細胞/ウェルCD40 - B細胞の培養に用いる照射
    3. フリーズして残り(必要に応じて)。
  6. 5分で225 × gで細胞をスピンダウン。
  7. 上清を取り除く。
    1. 継代培養のために:再懸濁し、1.5 × 10 6細胞を75センチメートル2細胞培養フラスコ(細胞密度1.5 × 10 5細胞/ mL)10 mLの野生型媒体において、[0.7 mg / mLの] G - 418を追加し、で細胞をインキュベート37℃、5%CO 2とC。週2回のセルを分割する。
    2. CD40 - B細胞の培養には:1つの6ウェルプレート用1.2 × 10 6細胞を必要とする。 0.1 × 10 6細胞/ mLの密度で野生型の培地で細胞を再懸濁し、78 Gyの時にそれらを照射する。よくそれぞれ、37でそれらをインキュベート° C、5%のCO 2に細胞懸濁液のプレートを2mL。 tCD40L NIH/3T3細胞が接着のときB細胞の刺激のために、この準備のプレートを使用する(少なくとも4時間:顕微鏡による遵守を確認するには、B細胞の刺激を開始するために24時間以上待機しません)。 (bに進みます。)

B. CD 40 - Bの細胞培養

CD40刺激(0日)のための末梢血単核細胞のI.の準備:

ご注意:あなたは、フィーダー細胞が接着していることを確かめる続行する前に。常に使用直前に増殖培地にインターロイキン-4およびシクロスポリンの新鮮なソリューションを追加します。

  1. 新鮮あるいは適切に融解したPBMCを、取る。再懸濁し、それらを洗浄し、他の細胞を除去するために7分間で190 × gで7分と二度目の256 × gで初めてスピンダウンするの1X PBS 50mLのに二回末梢血単核細胞。上清を捨て、PBS 20mLに細胞を懸濁します。細胞懸濁液の一定量の細胞数を決定します。
  2. 5分で225 xgで細胞の必要量をスピンダウン。 6ウェルプレート4の場合は× 10 6細胞/ウェルので、プレート当たり24 × 10 6細胞、必要とされています。
  3. 上清を除去し、新鮮なT -細胞の伸長を防止するための成長因子としてのインターロイキン-4および0.63μg/ mLのシクロスポリンの50 U / mLで補ったCD40 - B培地で1 × 10 6細胞/ mLでPBMCを再懸濁します。 (与えられた濃度は1枚のMLの培地を参照してください!)。
  4. 6ウェルプレートtCD40L NIH/3T3細胞をプレインキュベートから上清を取り除く。
  5. ウェルあたり最初とCD40 - B洗浄培地2mlで2番目のステップで2mLのPBSで接着tCD40L NIH/3T3細胞を洗浄。
  6. 穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにPBMC懸濁液を4mL(1 × 10 6細胞/ mL)を追加します。
  7. 37細胞をインキュベート° C、5%のCO 2。
  8. 7日目に、細胞を(3.2に進みます。)reculture。

II。 CD40 - B細胞(7日目、その後3〜4日ごと)のRecultivati​​on:

  1. 50 mlチューブに10 mLのピペットとプール一緒に再懸濁することにより6 - ウェルプレートからCD40 - B細胞の収穫クラスター。
  2. 7分で225 × gでスピンダウンし、完全にCD40 - Bの洗浄媒体を使用して上清を交換してください。アリコートの細胞の量をカウントしながら、5分間、225 xgで細胞をスピンダウン。 1 × 10 6細胞/ mLの濃度でCD40 - B培地で再懸濁し、CD40 - B細胞。
  3. 培地に50 U / mLおよび0.63μg/ mLのシクロスポリンの濃度のインターロイキン-4の新鮮なソリューションを追加。
  4. 6ウェルプレートtCD40L NIH/3T3細胞をプレインキュベートから上清を取り除く。
  5. よく最初とCD40 - B洗浄培地2mlで2番目のステップのあたり2mLのPBSで付着細胞を洗浄する。
  6. 6細胞/ mL)を追加します。
  7. 37プレートをインキュベート℃、5%のCO 2。
  8. 継代培養細胞は、再び3〜4日ごとに14日間の合計の後に高純度のヒトCD40活性化B細胞で終わるために。

C.トラブルシューティング - 何かのCD40 - B細胞は増殖しないのですか?

  1. あなたは、フィーダー細胞のCD40リガンド発現について確認しましたか?
  2. プレートに結合刺激のために使用されるフ​​ィーダー細胞は、24時間以上経過すべきではない?
  3. マイコプラズマ可能で汚染されていますか?
  4. 補充のために使用されるインターロイキン- 4ソリューションは、新鮮に解凍し、適切な生物学的活性を有していた?
  5. シクロスポリン正しい濃度で添加されたのはいつですか?

図1
図1:してくださいこちらをクリックして図1の拡大版のために。

図2
図2:してくださいこちらをクリックして図2の拡大バージョンのために。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

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