वैश्विक जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण एक Zebrafish Oligonucleotide माइक्रोएरे प्लेटफार्म का उपयोग करना

Biology

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Summary

जीन डीएनए जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा में एक जीनोम चौड़ा स्तर पर शक्तिशाली उपकरण हैं. इस प्रौद्योगिकी विकास जीव विज्ञान और विष विज्ञान सहित जैविक विषयों की एक किस्म में आवेदन किया है. इस वीडियो में, हम वैश्विक जीन अभिव्यक्ति zebrafish के लिए एक व्यापक oligonucleotide माइक्रोएरे मंच का उपयोग विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल विस्तार.

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Peterson, S. M., Freeman, J. L. Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform. J. Vis. Exp. (30), e1471, doi:10.3791/1471 (2009).

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Abstract

जीन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी एक जीनोम चौड़ा आधार पर मात्रात्मक और प्रतिलेख के स्तर के जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा माप परमिट. जीन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी विकास मंच के संबंध में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एक रोग राज्य सहित आवेदनों की एक किस्म में कई जैविक विषयों में प्रयोग किया जाता है, और विषाक्त प्रतिक्रिया में. इस के साथ साथ, हम वैश्विक जीन अभिव्यक्ति एक व्यापक zebrafish विशिष्ट oligonucleotide माइक्रोएरे मंच का उपयोग विश्लेषण के प्रदर्शन में शामिल हैं. zebrafish अभिव्यक्ति माइक्रोएरे मंच 385.000 जांच, लंबाई में 60 आधार जोड़े, के साथ 37,157 लक्ष्य पूछताछ लक्ष्य प्रति 12 जांच करने के लिए शामिल हैं. इस मंच के लिए, सभी सीडीएनए और जीनोमिक zebrafish के लिए उपलब्ध जानकारी (http://www.ensembl.org) Ensembl, वेगा (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC सहित विभिन्न जीनोमिक डेटाबेस से एकत्र किया गया था ( http://genome.ucsc.edu), और ZFIN (http://www.zfin.org). एक परिणाम के रूप में इस अभिव्यक्ति सरणी वर्तमान zebrafish transcriptome की पूरी कवरेज प्रदान करता है. zebrafish अभिव्यक्ति माइक्रोएरे Roche NimbleGen (मैडिसन, WI) के द्वारा मुद्रित किया गया था. यह तकनीकी प्रदर्शन एक सीडीएनए उत्पाद के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, लेबल सीडीएनए उत्पाद के माइक्रोएरे मंच करने के लिए संकरण, और संकेत अधिग्रहण के लिए एक रंग विश्लेषण रणनीति का उपयोग सरणी स्कैनिंग शामिल हैं.

Protocol

भाग 1: प्रतिदीप्त लेबल के सीडीएनए

Cy3 माइक्रोएरे प्रयोग में इस्तेमाल किया डाई तस्वीर क्षरण करने के लिए संवेदनशील है. प्रक्रिया प्रकाश की एक न्यूनतम राशि में जगह ले जाना चाहिए. लेबलिंग BioPrime ऐरे CGH जीनोमिक लेबलिंग प्रणाली 1 मैनुअल प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था.

  1. लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं BioPrime ऐरे CGH जीनोमिक लेबल सिस्टम पिघलना 2.5X रैंडम प्राइमर बफर, 10X dCTP मिश्रण, और nuclease मुफ्त पानी से. इसके अलावा Cy3 - dCTP डाई पिघलना. विगलन के बाद, संक्षेप में उपयोग करने से पहले सभी अभिकर्मकों अपकेंद्रित्र.
  2. एक अलग लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए प्रत्येक सीडीएनए के लिए विश्लेषण किया जा नमूना के लिए पूरा किया जा आवश्यकता होगी. 0.6 मिलीलीटर ट्यूब मोटी दीवारों में 500 सीडीएनए एनजी, 40 μl 2.5X रैंडम प्राइमर बफर और nuclease मुफ्त पानी 86 μl की कुल मात्रा को प्राप्त करने में जोड़ें.
  3. अच्छी तरह से मिलाएं और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र. 5 मिनट के लिए 100 पर प्रतिक्रिया ° सी thermocycler पर सेते हैं.
  4. 10 मिनट के लिए एक बर्फ स्नान घोल में तुरंत प्रतिक्रिया हस्तांतरण.
  5. प्रत्येक ट्यूब करने के लिए तो 10 μl 10X dCTP मिश्रण, 2 μl 1 मिमी Cy3 - dCTP और 2 μl Exo Klenow डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ें. Exo Klenow डीएनए पोलीमरेज़ फ्रीजर में छोड़ दिया जाना चाहिए जब तक जरूरत और हमेशा बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
  6. प्रतिक्रिया अच्छी तरह से मिलाएं और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र.
  7. Thermocycler में 16 घंटे के लिए 37 ° C पर प्रतिक्रिया सेते हैं.

भाग 2: लेबल सीडीएनए की वर्षा

  1. इससे पहले NimbleGen संकरण सिस्टम पर प्रोटोकॉल बारी में जारी रखने और प्रणाली 42 सी. सेंटीग्रेड संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं
  2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक Microcon स्तंभ जगह. लेबलिंग प्रतिक्रिया (100 μl) की सामग्री के बाद प्रत्येक स्तंभ के लिए 300 μl 0.1X एसएससी जोड़ें.
  3. 4 में 10 मिनट के लिए 16,100 XG पर स्तंभ युक्त ट्यूब डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र
  4. प्रवाह के माध्यम से, जो थोड़ा गुलाबी रंग में हो, और हो सकता है स्तंभ के लिए एक और 300 μl 0.1X एसएससी जोड़ने त्यागें.
  5. 4 में 10 मिनट के लिए 16,100 XG पर centrifugation दोहराएँ डिग्री सेल्सियस
  6. के माध्यम से प्रवाह को त्यागें और स्तंभ के लिए एक अतिरिक्त 300 μl 0.1X एसएससी जोड़ने.
  7. 4 में 12 मिनट के लिए 16,100 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  8. के माध्यम से प्रवाह त्यागें. प्रवाह के माध्यम से इस अंतिम धोने के बाद स्पष्ट हो और आप स्तंभ पर गुलाबी लेबल सीडीएनए देखने के लिए सक्षम होना चाहिए.
  9. 100 μl nuclease मुक्त पानी कॉलम को लागू करें. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से स्तंभ निकालें और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्तंभ पलटना.
  10. 4 में 2 मिनट के लिए 2300 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस पानी है कि ट्यूब के नीचे एकत्र में लेबल सीडीएनए rehydrated होना चाहिए.
  11. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ND-1000 का उपयोग डीएनए एकाग्रता की गणना और बेस की गणना के अनुपात डाई जहां Cy3 अनुपात करने के लिए nucleotide260 / 550 23.15 द्वारा गुणा अनुपात के बराबर होती है द्वारा डाई निगमन का मूल्यांकन. डाई अनुपात करने के लिए आधार 50 और 80 के बीच होना चाहिए.
  12. यदि सीडीएनए अगर पर्याप्त लेबल, विभाज्य 6 μg का एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सीडीएनए लेबल.
  13. एम 3 NaOAc, पीएच 5.2 और 1X isopropanol मात्रा के 0.1X मात्रा में मिलाएं. मिश्रण अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते की अनुमति दें.
  14. अगले 16,100 XG पर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र.
  15. डीएनए गोली, जो रंग में गुलाबी होना चाहिए परेशान बिना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  16. 500 μl 70% EtOH और कोमल उलटा द्वारा मिश्रण को जोड़कर एक इथेनॉल धोने का प्रदर्शन.
  17. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 16,100 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
  18. सतह पर तैरनेवाला निकालें, ट्यूब पलटना, और गोली 5 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं. इस चरण में गोली -20 पर भंडारित किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस अगर वांछित या प्रोटोकॉल संकरण कदम के लिए जारी किया जा सकता है.

भाग 3: संकरण

संकरण प्रक्रिया जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण 2 के लिए Roche NimbleGen Arrays है उपयोगकर्ता के गाइड से अनुकूलित है .

  1. Nuclease मुफ्त पानी के 5 μl में गोली भंग.
  2. एक बार गोली भंग संकरण तालिका 1 में सूचीबद्ध घटकों को जोड़ने. संकरण घटक Roche NimbleGen संकरण किट से हैं. उसके बाद सभी घटकों को जोड़ रहे हैं अब कुल मात्रा 18 μl कुल चाहिए. अच्छी तरह मिक्स और संक्षिप्त ट्यूब स्पिन तल पर सामग्री इकट्ठा.
  3. अगले कदम के लिए यह एक गर्मी ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए 95 ° C पर रखकर लेबल सीडीएनए denature है.
  4. तत्काल NimbleGen संकरण प्रणाली ट्यूब हस्तांतरण जबकि arrays निम्नलिखित चरणों में तैयार कर रहे हैं.
  5. प्रोटीन हमेशा ध्यान से संभाला जाना चाहिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार संग्रहीत. Roche NimbleGen अंधेरे में कमरे के तापमान पर desiccant के साथ उनकी अभिव्यक्ति arrays के भंडारण की सिफारिश की है.
  6. प्रेसिजन मिक्सर संरेखण (PMAT) उपकरण NimbleGen सरणी प्रसंस्करण सामान में प्रदान में सरणी लोड.
  7. <> ली PMAT पर एक X1 मिश्रक लोड और संदंश के साथ चिपकने वाली पट्टी हटायें. सुरक्षित PMAT बंद. PMAT में छेद के माध्यम से मिक्सर के लिए दबाव लागू करें और धीरे धीरे इतना खुला है कि सरणी और मिक्सर PMAT से छुड़ाना.
  8. मजबूती से मिक्सर के बाहर चारों ओर brayer के साथ दबाव लागू करने के लिए सरणी के लिए सील सुनिश्चित करने के लिए पूरा है और किसी भी बुलबुले को दूर. संकरण प्रणाली पर जटिल सरणी - मिक्सर प्लेस गर्म करने के लिए.
  9. एक विस्थापन विंदुक का प्रयोग, धीरे धीरे भरने के पोर्ट में लेबल नमूना के 15 μl जोड़ें. यह छेद मिक्सर के केंद्र में स्थित है. लागू धीमी और स्थिर विंदुक दबाव इतना है कि नमूना मिक्सर के माध्यम से किसी भी हवाई बुलबुले के बिना समान रूप से फैलता है. बंदरगाह छेद से किसी भी अतिरिक्त नमूना पोछो और चिपकने वाला स्ट्रिप्स के साथ बंदरगाह छेद सील.
  10. कुंडी बंद करें और संकरण NimbleGen संकरण सिस्टम पर कार्यक्रम बी का उपयोग कर समाधान के मिश्रण शुरू करते हैं. प्रोटीन 16-20 घंटे के लिए संकरण की अनुमति दें.

भाग 4: के बाद संकरण Washes और माइक्रोएरे की स्कैनिंग

धोने और स्कैनिंग प्रक्रिया Roche NimbleGen है Arrays उपयोगकर्ता गाइड जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए 2 से अनुकूलित है.

  1. एक बार संकरण पूरा के पास है धोने के रूप में तालिका 2 में उल्लिखित बफ़र्स तैयार है. पूर्व गर्म धो बफर आइए लिए 42 ° सी एक पानी के स्नान में.
  2. GenePix 4000B सरणी स्कैनर पर मुड़ें और स्कैनर का उपयोग करने से पहले के बारे में 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. पूर्व गर्म धो बफर आइए एक डिश में डालो.
  4. जिग (NimbleGen सरणी प्रसंस्करण सामान में आपूर्ति) में NimbleGen संकरण प्रणाली और स्लाइड से जटिल सरणी - मिक्सर निकालें. पूर्व गर्म धो बफर आइए में डूब विधानसभा और ध्यान से स्लाइड से दूर छीलने द्वारा मिक्सर हटायें.
  5. जिग और आंदोलन से धो बफर आइए में 15 सेकंड के लिए सरणी निकालें.
  6. जल्दी से कमरे के तापमान धो बफर आईबी में एक स्लाइड रैक में सरणी हस्तांतरण. 2 मिनट के लिए स्लाइड रैक तेजी से आंदोलन.
  7. धो बफर द्वितीय में स्लाइड रैक पर स्थानांतरण और 1 मिनट के लिए आंदोलन.
  8. स्लाइड रैक धो बफर III और आंदोलन में 15 सेकंड के लिए स्थानांतरण.
  9. अपकेंद्रित्र सुखाने स्लाइड में सरणी स्थानांतरण और सभी नमी को दूर करने के लिए 2 मिनट के लिए स्पिन. स्कैनिंग के लिए आगे बढ़ें.
  10. यह सरणी को तुरंत स्कैन के बाद से दोनों प्रकाश और ओजोन के लिए डाई संवेदनशील है की सिफारिश की है.
  11. सरणी, बारकोड, नीचे GenePix 4000B सरणी स्कैनर में लोड करें.
  12. GenePix प्रो सॉफ्टवेयर खोलें और सरणी की स्कैनिंग करने के लिए आगे बढ़ें. Roche NimbleGen जीन अभिव्यक्ति arrays एक रंग संकरण रणनीति का उपयोग. एक परिणाम के रूप में केवल एक ही तरंग लंबाई स्कैनिंग के लिए आवश्यक है. Cy3 प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग कर 532 एनएम लेजर स्कैन. हार्डवेयर की स्थापना संवाद बॉक्स खोलें और 500 के एक मूल्य के लिए 532 एनएम लेजर के PMT मान सेट.
  13. हार्डवेयर सेटिंग संवाद बॉक्स में, 100%, 5 microns के लिए पिक्सेल आकार, औसत के लिए 1 से लाइनों, सत्ता स्थापित करने और 0 microns से स्थिति ध्यान केंद्रित.
  14. एक पूर्वावलोकन स्कैन प्रदर्शन स्कैन क्षेत्र सेट.
  15. स्कैन करते हैं.
  16. एक बार स्कैनिंग छवि हिस्टोग्राम की जांच करने के लिए पूरा हो गया है. आदर्श रूप में 1e-5 सामान्यीकृत मायने रखता है +६५००० संतृप्ति सीमा जिसका अर्थ है कि सुविधाओं की ~ 1-2% संतृप्त कर रहे हैं पर होना चाहिए. यदि सामान्यीकृत मायने रखता है 1e-5 की तुलना में कम कर रहे हैं, PMT लाभ और रिस्कैन स्लाइड वृद्धि हुई है. यदि सामान्यीकृत मायने रखता है 1e-5 की तुलना में अधिक हैं, PMT लाभ और रिस्कैन स्लाइड कमी.
  17. एक बार स्कैनिंग छवि को बचाने के लिए पूरा हो गया है. यह संदर्भ में आसानी के लिए छवियों के लिए एक मानक नामकरण परिपाटी का चयन करने के लिए सिफारिश की है. छवि अब डेटा सामान्य और तीव्रता मूल्यों की गणना के लिए प्राथमिकता के डेटा विश्लेषण प्रोग्राम में लोड किया जा सकता है.

प्रतिनिधि परिणाम

तुम पहले जब एसएससी 0.1X washes के साथ शुरुआत सीडीएनए के Cy3 प्रतिदीप्ति लेबलिंग प्रतिक्रिया की दक्षता का आकलन शुरू कर सकते हैं. प्रत्येक बाद धोने के दौरान के माध्यम से प्रवाह कम स्पष्ट माध्यम से पिछले प्रवाह के साथ गुलाबी रंग में हो जाना चाहिए. इसके अलावा, Cy3 लेबल सीडीएनए उत्पाद स्तंभ पर दिखाई धोने के इन चरणों के दौरान किया जाना चाहिए. यदि प्रवाह के माध्यम से रंग में गुलाबी उज्ज्वल है या स्तंभ पर कोई गुलाबी उत्पाद है, यह एक अच्छा संकेत है कि लेबलिंग प्रतिक्रिया सही ढंग से आगे नहीं किया है. लेबलिंग प्रतिक्रिया मात्रात्मक NanoDrop ND-1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए लेबल डीएनए और डाई अनुपात (चित्रा 1) के लिए आधार की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है है. लेबलिंग प्रतिक्रिया नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में लेबल डीएनए के कम से कम 10 μg पैदावार. डाई निगमन एक सरल अनुपात / आधार डाई जहां Cy3 अनुपात करने के लिए nucleotide ए 260 / 550 23.15 द्वारा गुणा अनुपात के बराबर होती है का उपयोग करके गणना की जा सकती है . 50-80 से लेकर मान लेबलिंग प्रतिक्रिया में पर्याप्त डाई समावेश का संकेत मिलता है. यदि लेबलिंग प्रतिक्रिया mic पर डीएनए या गरीब डाई निगमन, नमूने के संकरण के एक कम एकाग्रता पैदावारroarray सिफारिश की है और लेबलिंग प्रतिक्रिया नहीं दोहराया जाना चाहिए है.

संकरण की गुणवत्ता का मूल्यांकन छवि हिस्टोग्राम और माइक्रोएरे (चित्रा 2) के स्कैन की गई छवि के मूल्यांकन के द्वारा आयोजित किया जा सकता है. PMT मान 500 के पास सेट के साथ स्वीकार्य hybridizations संतृप्त सुविधाओं का 1-2% (यानी, उपज 1e-5 +६५००० संतृप्ति सीमा पर सामान्यीकृत मायने रखता है) होगा. यदि PMT मान करने के लिए तेजी से 500 से समायोजित किया जा 65,000 संतृप्ति सीमा पर 1e-5 सामान्यीकृत मायने रखता है पाने है, यह आम तौर पर लेबल माइक्रोएरे के लिए सीडीएनए के गरीब संकरण इंगित करता है. अगर इस डेटा के बाद के विश्लेषण के माध्यम से जारी रखा है डेटा गुणवत्ता शामिल किया जाएगा. संकरण गुणवत्ता भी गुणात्मक स्कैन सरणी (चित्रा 3) की छवियों को देखने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. Roche NimbleGen संकरण किट के एक संरेखण oligo मिश्रण Cy3 और Cy5 लेबल 48mer oligonucleotides कि arrays पर संरेखण सुविधाओं के संकरण शामिल हैं. सरणी पर अन्य सुविधाओं के लिए संरेखण oligos की तीव्रता का गुणात्मक मूल्यांकन fluorescently लेबल सीडीएनए के संकरण दक्षता पर सरणी पर एक गुणवत्ता की जांच परमिट. आगे के विश्लेषण के बाद, अपने डेटा का विश्लेषण के एक तितर बितर साजिश जीन अभिव्यक्ति के रिश्तेदार का स्तर निर्धारित करने के लिए और जीन है कि विभिन्न प्रकार से अपने नमूने (चित्रा 4) के बीच व्यक्त कर रहे हैं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1 के थंबनेल
चित्रा 1. सीडीएनए Cy3 के साथ लेबल. लेबल सीडीएनए उपज और डाई समावेश से NanoDrop स्पेक्ट्रम NanoDrop ND-1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 1 के थंबनेल
चित्रा 2. संकरण की माइक्रोएरे स्कैन गुणवत्ता के लिए एक GenePix हिस्टोग्राम छवि हिस्टोग्राम मूल्यांकन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. स्वीकार्य hybridizations +६५००० PMT 500 के पास निर्धारित मूल्य के साथ संतृप्ति सीमा पर 1e-5 सामान्यीकृत मायने रखता है के साथ संतृप्त सुविधाओं का 1-2% है. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक स्कैन माइक्रोएरे छवि गुणवत्ता संकरण. माइक्रोएरे की स्कैन की गई छवि को देखने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है . छवि धूल या अन्य हस्तक्षेप प्रत्येक सुविधा के दृश्य पर रोक लगाने कारकों की उपस्थिति के लिए जांच की जानी चाहिए और इस तरह, सुविधा के प्रतिदीप्ति तीव्रता के सटीक गणना को रोकने. संरेखण oligos की तीव्रता संकरण दक्षता का आकलन करने के लिए सरणी पर अन्य सुविधाओं के लिए तुलना की जा सकती है.

चित्रा 4
चित्रा 4. इस प्रक्रिया के एक विश्लेषण माइक्रोएरे प्रयोग के एक तितर बितर साजिश लक्ष्य करने के लिए जीन है कि विभिन्न प्रकार से अपने नमूनों में व्यक्त कर रहे हैं की पहचान है. माइक्रोएरे डेटा आगे और विश्लेषण कर सकते हैं एक तितर बितर साजिश में देखा करने के लिए जीन है कि विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं कल्पना.

तालिका 1 Roche NimbleGen संकरण किट से अवयव संकरण चरण 2 के लिए जोड़ने के लिए. .

घटक आयतन
नमूना (पानी में भंग) 5 μl
2X संकरण बफर 9 μl
Hyb एक 3.6 μl
संरेखण oligo 0.4 μl
कुल मात्रा 18 μl

टेबल 2. धो बफ़र्स संकरण निम्नलिखित सरणियों की धुलाई के लिए तैयार रहना .

घटक धो बफर आइए * बफर आईबी धो द्वितीय धो बफर धो बफर III
पानी 225 मिलीलीटर 225 मिलीलीटर 225 मिलीलीटर 225 मिलीलीटर
10X धो बफर मैं, द्वितीय, या तृतीय 25 मिलीलीटर 25 मिलीलीटर 25 मिलीलीटर 25 मिलीलीटर
1 एम डीटीटी 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl
कुल मात्रा 250 मिलीलीटर 250 मिलीलीटर 250 मिलीलीटर 250 मिलीलीटर

* 42 पूर्व गर्म डिग्री सेल्सियस

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Discussion

यहाँ विस्तृत सहित कई माइक्रोएरे प्रोटोकॉल, मापने और बढ़ाता संकरण के एक साधन के के रूप में उपयोग फ्लोरोसेंट रंजक. Cy3 फ्लोरोसेंट रंजक फोटो और ओजोन क्षरण के प्रति संवेदनशील है. यह अनुशंसा की जाती है कि प्रक्रिया कम से कम प्रकाश में आयोजित किया. इसके अलावा, छोटे धूल कणों संकरण और स्कैनिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. विशेष ध्यान करने के लिए सुनिश्चित करें कि कार्य क्षेत्र को साफ और धूल से मुक्त है बनाने के लिए दी जानी चाहिए.

लेबलिंग इस कार्यविधि में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए कई विकल्प हैं. यह सिफारिश की है कि विभिन्न लेबलिंग प्रोटोकॉल के प्रत्येक विशिष्ट अभिव्यक्ति माइक्रोएरे मंच के लिए इष्टतम लेबलिंग प्रक्रिया निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया. प्रक्रिया यहाँ का प्रदर्शन इस विशिष्ट अभिव्यक्ति सरणी Roche NimbleGen द्वारा मुद्रित मंच के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया. इसके अलावा, हम लेबलिंग Roche NimbleGen ऐरे उपयोगकर्ता के गाइड के रूप में समान रूप से अच्छी तरह से काम में विस्तृत प्रोटोकॉल में पाया गया है. सावधानी अगर विशेष रूप से अन्य निर्माताओं से अन्य अभिव्यक्ति सरणी प्लेटफार्मों, के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने में प्रयोग किया जाना चाहिए, संकरण गुण के रूप में मोटे तौर पर मंच के मुद्रण विधियों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं.

हमारे शाही सेना अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण प्रोटोकॉल के लिए इस अभिव्यक्ति सरणी प्रोटोकॉल युग्मन नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उच्च गुणवत्ता वाले जीन की अभिव्यक्ति सरणी डेटा पैदावार. यह सब अभिव्यक्ति सरणी विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है कि फाइनल में डेटा की गुणवत्ता अंततः इन प्रारंभिक कदम की गुणवत्ता पर निर्भर है. इन चरणों का अंतिम अभिव्यक्ति सरणी विश्लेषण करने के लिए अग्रणी के किसी एक इष्टतम परिणाम कम से कम अंतिम डेटा की गुणवत्ता में बाधा जाएगा.

सीडीएनए के संकेत अधिग्रहण के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग से इस वीडियो में प्रस्तुत प्रक्रियाओं अभिव्यक्ति प्रयोगात्मक प्रश्न के स्वतंत्र सरणी विश्लेषण के लिए मानक प्रक्रिया है. दिशा में जो छवि अधिग्रहण के बाद अभिव्यक्ति सरणी डेटा के विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग पर काफी हद तक निर्भर है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Array Microcentrifuge Dryer ISC Bioexpress C-1303-T
BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Invitrogen 18095-011
Cyanine 3-dCTP PerkinElmer, Inc. NEL576
GenePix 4000B Molecular Devices GENEPIX 4000B
Microcon YM-30 EMD Millipore 42411
NimbleGen Array Processing Accessories Roche Group 5223539001
NimbleGen Hybridization Kit Roche Group 5223474001
NimbleGen Hybridization System 4 Roche Group 5223652001
NimbleGen Wash Buffer Kit Roche Group 5223504001
X1 Mixers Roche Group 5223725001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. Version C. (2004).
  2. Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. Version 3 (2008).

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