Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Biology
 

Summary

Bu prosedür, Gen Verici MXcell elektroporasyon sistemi hızlı ve kolay bir fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) veya diğer birincil hücreler için en iyi elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. Sorun giderme için dikkat edilmesi gereken noktalar da ilgili video tartışılmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McCoy, A. M., Collins, M. L., Ugozzoli, L. A. Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency. J. Vis. Exp. (35), e1662, doi:10.3791/1662 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektroporasyon birincil hücre içine plazmid DNA veya siRNA tanıtmak için en etkili yolu olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve Gen Verici elektroporasyon tampon (Bio-Rad), özellikle memeli hücrelerinde ve birincil ve kök hücreleri gibi zor transfect hücreleri, nükleik asitler kolayca transfect için geliştirilmiştir. Biz iyi elektroporasyon koşulları hızla tanımlamak için basit bir deney gerçekleştirmek için nasıl göstereceğiz. Biz bir deney optimizasyonu yapılır aynı zamanda yapılabilir, böylece elektroporasyon koşulları bir dizi yoluyla çeşitli örnekleri çalıştırmak için nasıl göstereceğiz. Biz de en uygun koşulları, aynı elektroporasyon verimliliği korurken, standart elektroporasyon küvetler kullanılabilir 96-iyi elektroporasyon plakaları kullanarak elektroporasyon küvetler elektroporasyon plakalardan geçiş kolaylaştırmak tespit nasıl gösterecektir. Video, elektroporasyon deneyler başarı ya da başarısızlığa yol açabilecek bazı önemli faktörler de ele alınacaktır.

Protocol

1) Hücre hazırlık

  1. Yapışık hücrelere kullanırken, trypsinize ve elektroporasyon önce hücreleri toplamak için gereklidir.
  2. Üç farklı geçit numaraları temsil eden dört fare embriyonik fibroblast (MEF) kültürleri, arasında transfeksiyon karşılaştırmak için, her bir şişesi aşağıdaki gerçekleştirin.
  3. Hücre kültür ortamı aspire.
  4. Hücreleri yıkamak için PBS ekleyin.
  5. PBS çıkarın; hücreleri kapsayacak şekilde yeterli tripsin ve tripsin hücreleri ayırmak için izin vermek için birkaç dakika bekleyin.
  6. Hücrelerin durumunu doğrulamak için bir mikroskop ile şişeler kontrol hücreleri ayırmak için balon şaplak ve sonra, emin hücreleri tüm müstakil olmak için tekrar şişeyi kontrol edin.
  7. Ek süre ve gerekirse tekrar bekleyin.
  8. Tüm hücreleri müstakil sonra, tripsin nötralize etmek için serum içeren medya ekleyin.
  9. Hücrelerin bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj yoluyla pelet hücreleri (RCF = 300 xg).
  10. PBS bilinen bir ses supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
  11. Hücreleri saymak.
  12. Uygun hacimli hücre süspansiyonu, deneyler için hücreler (1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu hücreleri de ortalama 150 mcL gerekecektir) gerekli sayıda sağlamak için yeni bir tüpe aktarın .
  13. Santrifüj hücreleri.
  14. Gene Verici elektroporasyon 1 x 10 6 hücre / mL bir hücre yoğunluğu elde etmek için tampon uygun hacmi supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
  15. Hücre süspansiyonu plazmid başına mL 20 mg ekleyin ve hafifçe karıştırın.

2) Elektroporasyon damar kurulum ve elektroporasyon

Plaka kurulum ve elektroporasyon

  1. Gene Verici MXcell elektroporasyon sisteminin güç modülü takın plaka odası.
  2. Pipet 150 mcL hücre karışımı ya da 96-kuyu elektroporasyon plaka kuyu içine tampon.
  3. Plaka odası ve nabız plaka koyun.
  4. Odasından plaka çıkarın.
  5. Her bir kuyunun içinde yukarı ve aşağı pipetleme iyi içeriği karıştırın.
  6. Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın.
  7. Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak.
  8. Hücreler 24 saat kurtarmanızı sağlar.

Küvet kurulum ve elektroporasyon

  1. ShockPod Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve fiş ™ küvet kamara güç modülü plaka odasına çıkarın.
  2. Pipet 600 mcL 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvet içine hücre süspansiyonu.
  3. ShockPod odasına küvet koyun ve elektrik darbe sağlamak.
  4. Küvet odasından çıkarın.
  5. Küvet içinde yukarı ve aşağı pipetleme küvet içeriğini karıştırın.
  6. Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın.
  7. Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak.
  8. Hücreler 24 saat geri alalım.

3) Temsilci Sonuçlar

Hücreleri transfecting ve onları kurtarmak için izin sonra, flow sitometri kullanarak epifluorescent mikroskopi kullanılarak kantitatif, kalitatif transfeksiyon verimlilik, analiz ve.

Şekil 1
Şekil 1. başarıyla electroporated ve şimdi, GFP geninin ifade Hücreler epifluorescent mikroskobu altında görünür.

Şekil 2
Şekil 2 faz kontrast altında hücreleri görüntüleme hem transfekte ve untransfected hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bunlar 200V düşük voltaj elektroporasyon darbe maruz kaldılar hücrelerdir. Hücreler yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyük ölçüde konfluent.

Şekil 3
Şekil 3, Epifloresans altında bakış aynı alanda bir dizi hücreleri GFP işaretleyici ifade gösterir, ama bu sadece küçük bir yüzdesi önceki resim görünür hücreleri .

Şekil 4
Şekil 4 250V, faz kontrast altında görülen canlı hücrelerinin toplam sayısı biraz azalır.

Şekil 5
Epifloresans altında bir Şekil 5 GFP ifade hücrelerinin sayısının arttığını görebilirsiniz.

Şekil 6
Şekil 6, en yüksek voltaj 375V uygulanan, daha az görünür canlı hücreler vardır.

Şekil 7
Şekil 7 Ancak, geri kalan hücreler büyük bir yüzdesi, GFP ifade edilmektedir. Hangi durum optimal deney tasarımı bağlıdır. Bazı deneylerde transfekte hücrelerinin en büyük sayı diğer deneylerde en yüksek yüzde transfeksiyon belki de en iyisi, en uygun olabilir.

Biz her koşul altında olumlu GFP ve yüzdeleri hücre yaşla birlikte değişir hücrelerin yüzdesi olarak ilgilenen. Flow sitometri, her farklı elektroporasyon koşullar altında transfeksiyon sonuçları hakkında kantitatif bilgi sağlayabilir.

Şekil 8
Şekil 8 12 elektroporasyon koşulların her birinin altında 5 hücre gösterilen pasajda olumlu GFP hücre yüzdesi. Durumu 12, maksimum transfeksiyon yüzdesi güçlü kare dalga darbe altında yüksek voltaj üstel çürüme darbe, durumu 6 ve% 70 altında yaklaşık% 80, test.

Şekil 9
Şekil 9 hücrelerin elektroporasyon önce 9 kez geçti, transfeksiyon yüzde genel desen neredeyse aynıdır, ancak çok hafif bir azalma ile transfeksiyon yüzdeleri.

Şekil 10
Şekil 10 Burada gösterilen geçit genç hücrelere göre transfeksiyon yüzdesinde belirgin bir azalma göstermektedir 13 hücreler, GFP hücrelerinin yüzdeleri. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri yaklaşık yarısı, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanarak önemini gösteren genç hücreleri ne ile elde edildi.

Gene Verici MXcell kullanarak transfecting MEF hücreleri için kullanılan Elektroporasyon Koşullar
Durumu (1-6)
Üstel Bozunma bakliyat,
350 uF, 1000ohm
Voltaj (V)
1 200
2 250
3 300
4 326
5 350
6 376
Durumu (7-12)
Kare Dalga bakliyat,
2000 uF, 1000 ohm ve 1 darbe
Voltaj (V) Darbe Süresi (ms)
7 200 10
8 250 10
9 300 10
10 200 20
11 250 20
12 300 20

Discussion

Bu video makale MXcell elektroporasyon sistemi kolayca MEFS veya diğer birincil hücre hatları için optimal elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. 96-plaka biçimi, pek çok, pek çok ayrı deneyler için ihtiyacını ortadan kaldırabilir aynı anda yapılacak deneysel ya da en iyi duruma getirme koşullarını, çoğaltır için izin verir. Bu yordamı yürütürken, bir, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanmak ve elektroporasyon tampon eşleştirilir elektroporasyon koşulları kullanmak için hatırlamak gerekir.

Disclosures

Yazarlar, bu yazıda kullanılan reaktifler ve alet üreten Bio-Rad Laboratories tarafından istihdam edilmektedirler

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer Bio-Rad 165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System Bio-Rad 165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber Bio-Rad 165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber Bio-Rad 165-2674

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

9 Comments

  1. We are using a Gene Pulser II to transfect MEFs. Do you have a recommendation for conditions to try?
    Thank you,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 15, 2011 - 10:34 AM
  2. MEFs and other primary cells can optimize at different conditions due to variation among cells and differences in the methods used to generate the MEFs. For best results, we recommend optimizing to identify the best conditions for your experiment. There is a good chance that you will achieve success with the conditions used here although they may not be the absolute best conditions for your particular MEFs. I would recommend using 375V and 350 uF on your GP II with 600 ul of cells resuspended in the Gene Pulser electroporation buffer in a 0.4 cm cuvette as a good starting point. Alternatively, ²50V and 500 uF capacitance would be another good starting point. With a gene pulser II you will want to set the voltage to either 375V or ²50V then set the capacitance to high capacitance setting. The high capacitance settings need to be multiplied by 1000 to get units of uF, so a setting of 0.35 is 350 uf and 0.5 for 500 uF. I hope that helps!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 19, 2011 - 1:56 PM
  3. We are using a gene pulser (Bio-Rad, Richmond, CA) to transfect adipose tissue stem cells. We want to transfect the cells by electroporation (²50 V, 500 v, 900 v and 1500 v, pulse time 30 ms), but we dont know which capacitance, current and resistane is approperiatefor this. Do you have any recommendation in this regard?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2011 - 6:41 AM
  4. Hello, Thank you for your inquiry. It seems you are interested in using a square wave protocol. Bio-Rad Gene Pulser systems can use either exponential or square wave protocols. The set up will be slightly different depending on which system you have (Gene Pulser I, Gene Pulser II, Gene Pulser Xcell or Gene Pulser MXcell) and also the buffer you will be using. We would suggest you try optimizing conditions using the wide range of voltages you have listed. Generally speaking, we have found lower voltages and higher capacitance settings to be best for difficult to transfect cells (such as stem cells). A starting point for a square wave protocol might be ²50V, 950 uF, 30 ms pulse. You can similarly try a wide range of conditions using exponential decay pulses. A starting point for exponential protocols might be ²50V, ²00uF, and 1000 ohms.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 14, 2012 - 11:32 AM
  5. We are using the Gene Pulser Xcell system. Must we use the Gene Pulser electroporation buffer to get a high transfection efficiency? And where can I find the optimal capicitance for the medium or buffer I am currently using? Moreover, how will the size of the cuvettes and volume of cell suspension influence the transfection efficiency?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2012 - 3:00 AM
  6. Crystal, thank you for the questions. It depends on the type of cells you are working with. Gene Pulser electroporation buffer is recommended for mammalian cells especially difficult to transfect cells including primary and stem cells. Other buffers may be sufficient as well. Gene Pulser electroporation buffer can yield both high transfection efficiency and high viability in difficult cell lines. Because of the electrical properties of the buffer it also gives pretty consistent results which helps greatly with optimization.

    Both size of the cuvette and volume of cell suspension should also been taken into consideration when optimizing electroporation conditions as these will alter the electric fields. You can achieve essentially the same electric field through different combinations of parameters. The goal is to find the conditions which work best with your cells and your biological question. If you change the volume of cell suspension you will need to change the conditions applied to achieve the same electrical field. I normally recommend determining the volume and cuvette size you need first, and then optimizing the instrument settings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 14, 2012 - 11:33 AM
  7. I am setting up an electroporation experiment using mouse primary MEF and my question is...using the Gene pulser MXcell, I want to know if one condition is good for a 0.4 cuvette size, would the same condition be good for 0.² cuvette size for the electroporation expt.

    Reply
    Posted by: saiphone w.
    August 16, 2012 - 2:48 PM
  8. Hi,
    Thanks for the video. I actually have a problem with getting good viability for urine iPSC. We've been trying to do a successful electroporation with has indicated episomal plasmids using AmaxaTm basic nucleofectorTM kit for primary mammalian epithelial cells, program we used is T-020 from LONZA) but it seems that the GFP vector isn't doing its job very well as we're having trouble to have our Urine iPSC to grow after electroporated using the gene pulser from bio rad)...
    anyways have any suggestions or ideas as to why is this happening?

    Thank you!

    Reply
    Posted by: Emily R.
    January 15, 2014 - 4:19 AM
  9. Hi,
    we want to use Amaxa Nucleofector to transfect CMT93 cells (mouse colorectal cancer). Do you have a recommendation for conditions to try?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Vasiliki Z.
    April 10, 2016 - 9:59 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics