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로블롤리 파인로부터 RNA 분리의 개선 방법 ( P. taeda L.) 및 기타 코니퍼 종

Biology

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Summary

체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 (

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Lorenz, W. W., Yu, Y., Dean, J. F. An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species. J. Vis. Exp. (36), e1751, doi:10.3791/1751 (2010).

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Abstract

조직은 로블롤리 파인로 특히 침엽수 종, Pinaceae 가족에 속한 사람 (격리

Protocol

1 부 : 트리 하베스트

나무를 선택하고 넘어가는되면 그것은 신중하게 최대한 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 각기 다른 조직 유형이 수확이므로 시료 물질의 교차 오염을 피하기 위해, 그들은 자신의 액체 질소 용기에 즉시 배치해야합니다. 이 RNA 격리 프로토콜은 확장성입니다.

  1. 약 0.5-0.75 m의 길이로 볼트를 잘라 전기톱 점수와 두 개 또는 세 곳에 껍질은 볼트의 세로축을 따라.
  2. 껍질 그것이 줄기에서 완전히 분리까지 나무에서 별도의 껍질 부분에 다시 당기면서 정을 작업을 계속하기 시작 때까지 나무 치즐 사용하여 점수 영역의 가장자리를 작동합니다.
  3. 보조 목부는 껍질 벗겨지고되었습니다 볼트의 길이 방향 축을 따라 스크레이핑하여 직선 가장자리, 단일 양면 레이저와 수확이다. 조직의 오염을 최소화하기 위해 라텍스 장갑을 착용한다.
  4. 껍질 섹션의 안쪽에 위치한 체관부는, 쉽게 필링 매뉴얼에 의해 수확이다.
  5. 반응 나무는 존중 땅에 그들의 원래 방향을 표시하는 스프레이 페인트를 표시한 다음 사지의 아래쪽에서 수집됩니다.
  6. 팔다리는 1-2미터의 볼트로 잘라 반응 나무의 두 가지 유형의 대략적인 위치에 따라 세로 축을 따라 반대편에 점수입니다 반대 우드 (사지의 상단쪽에)과 압축 나무 (하단에 사지의 측면). 나무 껍질은 반응 나무의 각 유형을 덮고있는 껍질이 한 번에 제거는 것을 제외하고 위에 설명된대로 갈기갈기 구분합니다. 위에서 설명한 및 액체 질소에 배치 보조 목부 또는 체관부 그 다음 수집됩니다.
  7. 이러한 바늘, 촬영 팁, 젊은 원뿔 같은 다른 샘플은, 손으로 수확하거나 필요한 가지치기 가위를 사용하실 수 있습니다.
  8. 액화 질소에 냉동 수집 샘플이 표시되어 가방이나 적당한 용기에 위치하고 연구실로 돌아 출하를위한 드라이 아이스로 포장해야합니다.

2 부 : 샘플 냉장고 밀 처리

  1. 액체 질소로 Spex 6,850 냉동고 밀 저수지 작성 및 연삭 유리병 중 하나에 영향을 막대를 장소와 사전 진정 액체 질소로 입력합니다. 액체 질소를 붓고하고 병을 샘플을 추가합니다.
  2. 더 초과 액체 질소는 밀링 챔버에 남아없고 마개가 챔버 밀봉하는 장착되어 전에 여분의 질소 가스를 완전히 배출되어 있는지 확인합니다.
  3. 캐리어와 가까이에 연삭 병을 넣습니다.
  4. 14 속도 설정 1 분 / 사이클의 두 사이클에 대한 밀 우디 샘플.
  5. 사전 냉장되고 액체 질소를 소량 이나마 갖고있는 비커에 가공된 샘플 (나무 가루)을 제거하는 액체 질소 냉각 주걱을 사용합니다.
  6. 필요한 ° C까지 -80에서 보관 컨테이너와 장소에 액체 질소 / 샘플 슬러리 하거라.

파트 3 : RNA 분리, 1 일

  1. 50mL 덮인 팰컨 튜브에 RNA 격리 버퍼의 20mL 플레이스 후 400 μL β - 메르 캅 토 에탄올, 소용돌이 잠깐, 60 ° C의 물을 욕조에 열을 추가합니다.
  2. 각각의 튜브에 동결 조직 4g을 추가합니다. 총액 10 초 동안 vortexing 다음 손으로 적극적으로 흔들.
  3. 튜브에 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가하고 섞어 부드럽게 반전. 회전 바퀴에 튜브를 삽입하고 5 분 이상의 엔드 - 엔드는 혼합 수 있습니다.
  4. 12,000 (17,200 XG) 5 분 SS34 고정 앵글 로터의 RPM에서 50 ML 오크 리지 관과 원심 분리기로 혼합물을 가만히 따르다.
  5. 새로운 오크 리지 관에 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 절반 볼륨을 추가합니다.
  6. 1 분 5 분 회전 바퀴에서 혼합 지속을위한 와동. 5 분 SS34 고정 각도 로터의 12,000 RPM (17,200 XG)에서 원심 분리기.
  7. 신선한 오크 리지 관에 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 절반 볼륨을 추가합니다. 1 분 와동. 10 분 SS34 고정 각도 로터의 12,000 RPM (17,200 XG)에서 원심 분리기.
  8. 50 ML 고속 폴리 프로필렌 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 20 분 SS34 고정 각도 로터의 10,000 RPM (11,900 XG)에서 원심 분리기.
  9. 가만히 따르다의 50 ML 팔콘 튜브에 뜨는 및 뜨는에 25 볼륨 10 M LiCl 솔루션을 추가합니다. 4 간단히 와동과 장소 ° 하루 강수량을위한 C.

4 부 : RNA 분리, 날 2

  1. 시작하기 전에하는 65 ° C의 물을 욕조에서 열 SSTE 버퍼.
  2. 4 30 분 SS34 고정 각도 로터의 11,000 RPM (14,450 XG)에서 원심 분리하여 폴리 프로필렌 튜브 및 펠릿 RNA에 LiCl - 시켰던 샘플을 부어 ° C.
  3. 원심 분리 후,에서 붓다와 액체를 폐기하고, 약 1 분 Kimwipes에 튜브를 반전. 남은 뜨는을 피펫.
  4. 철저하게 샘플을 혼합하는 피펫을 사용하여 가열 SSTE 800 μL의 각 펠렛을 Resuspend. 2 ML 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 resuspended 샘플을 전송합니다.
  5. 열 샘플 65 ° C 전체 resuspension을 보장하기 위해 적극적으로 vortexing 다음 2 분.
  6. 각 샘플 튜브로, 페놀 - 클로로포름, pH8의 동일한 볼륨을 추가합니다. 다음 30 초 동안 와동 각 샘플과 3 분 동안 14,000 rpm으로 microfuge에 스핀
  7. 새로운 2mL의 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 수성 단계를 전송하고, 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 30 초 3 분 14,000 RPM에서 microfuge의 스핀을위한 와동 각각의 샘플을.
  8. 이전에 2 분 동안 11,000 rpm으로 microfuging에 의해 준비되었습니다 페이즈 록 젤 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 클로로포름의 절반 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞어 피펫.
  9. 5 분 11,000 rpm으로 원심 분리기와 신선한 2mL 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 수성 단계를 전송합니다.

제 5 부 : RNA 강수 및 에탄올 워시

  1. 50 μL의 3.0 M 아세트산 나트륨, 산도 4.8 및 수성 단계 1 ML 100 % 에탄올을 추가합니다. -80의 소용돌이와 침전물 ° -20시 30 분 야간을위한 C ° C.
  2. Microfuge 샘플 14,000 4 30 분 RPM ° C, 그리고 신중하게 뜨는을 대기음에서. 펠렛을 방해하지 마십시오.
  3. 1 ML -20 ° C 70% (V / V) 에탄올과 RNA 알약을 씻으십시오. 1 분 14,000 RPM에서 Microfuge과 에탄올을 대기음.
  4. 5.3 단계를 반복합니다.
  5. 3~5분에 대한 벤치에 튜브 공기 건조 알약을 모자를 벗다.

6 부 : 최종 Resuspension 및 부량

  1. 100 μL DEPC - 처리된 물의 각 펠렛을 Resuspend. vortexing으로 믹스하고 얼음에 넣어 전에 2 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어. 샘플 resuspension을 보장하기 위해 필요한 경우 반복합니다.
  2. 원하는 및 분광 quantitation 위해 10mM 트리스, 산도 7.5의 1시 10분 희석의 50 μL를하면 샘플이 같은 풀. 280분의 260 및 230분의 260 대한 흡광도 비율은 일반적으로 각각 2.1 및 2.2보다 큰 수 있습니다. 60 - 120μg / g 냉동 조직에서 RNA의 분리 수율 범위.
  3. 태 버퍼의 1 % 아가로 오스 겔에서 1.5-2.5 μg의 RNA를 실행하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 더 중요한 샘플, 제조 업체의 지침에 따라 같은 애질런트 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA를 분석합니다.

대표 결과 :

다른 코니퍼 조직 범위에서 RNA의 분리 수율은 60-120에서 우디 샘플 μg / g 냉동 조직은 일반적으로 70-80g / G 냉동 조직 주위에 항복. 280분의 260과 230분의 260의 진단 비율은 모두 2.1보다 일반적으로 더 큰되며, RNA 샘플은 각각 어떤 의미 페놀 수지 carbon이나 탄수화물 오염은 무료입니다 좋은 지표입니다. EtBr의 얼룩 다음 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분석 샘플은 초, 18S 및 5S RNA (그림 1) 세 가지 서로 다른 밴드를 표시해야합니다. 아가로 오스 젤에 18S에 28S의 stoichiometry 결정하는 것은 다소 주관적이며, 같은 젤, 얼룩 및 샘플 부하 조건을 실행 같은 요인 모두 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로, 28S의 경우 : 18S 비율> 1.5로 나타납니다. 그러나, 일부 침엽수 샘플 낮은 비율을했습니다. 예를 들어, 애​​질런트 2100 분석 다음 우리는 stoichiometry이 1.2:1에 가까운 다양한 조직 유형에서 코니퍼 샘플의 여러 인스턴스를 볼 수 있습니다. 따라서 명백한 낮은 28S : 18S 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 stoichiometry 반드시 가난한 품질의 샘플을 표시하지 않습니다. 나뭇잎이, 이런, 원뿔 샘플은 종종 추가 뚜렷한 밴드가 chloroplastic ribosomal RNAS로 인해 제공합니다. 물론 표본이나 높은 분자 질량 밴드 (> 8-10킬로바이트)에서 마이 그 레이션하지 EtBr 묻은 물질은 일반적으로 게놈 DNA 오염 (그림 2)를 나타냅니다. 5S 밴드와 감소 ribosomal 밴드 얼룩 또는> 28S의 stoichiometry은 RNA 저하는 (그림 3) 발생했음을 좋은 지표 명백한 18S이나 아래 부근에있는 낮은 분자 질량 뭉개진. 애질런트 2100 electropherogram 분석에서,베이스 라인은 18S와 28S 28S ribosomal하는 데 RNAS에 해당하는 주요 봉우리와 낮은 비교적 부드럽게한다 : 1.2에서 2.0으로 어디까지 18S 비율. 애질런트 RNA 무결성 번호 (RIN) 가치 RNA 품질의 더 나은 예측 수 있으며 microarray 목표의 준비를 위해 사용하는 RNA에 대한 최소 7 이상되어야합니다. 18S : 그림 5 28S에 의해 공개로 RNA 준비는 매우 높은 기준과 눈에 띄는 저하가 발생 가난한 목부를 보여줍니다 동안 1.4 동등 18S 비율과 8.6의 RIN 값 : 그림 4는 28S와 목부의 RNA에 대한 전형적인 애질런트 2100 electropherogram을 보여줍니다 라0.65과 3.4의 RIN 가치와 동일 티오.

그림 1
고품질 소나무 RNA의 그림 1. 아가로 오스 겔의 분석. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 레인 2 특성 ribosomal 28S, 18S, 5S 및 밴드와 명백한 28S와 로블롤리 파인 보조 목부에서 전형적인 총 RNA 분리를 보여줍니다 : 18S 비율> 1.

그림 2
소나무 RNA 샘플의 그림 2. 아가로 오스 겔의 분석은 게놈 DNA가 오염. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 레인 2, 게놈 DNA 오염을 보여주는 목부 RNA 샘플.

그림 3
RNA의 저하 및 게놈 DNA와 오염을 보여주는 소나무의 샘플 그림 3. 아가로 오스 겔의 분석. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 Lane2, 게놈 DNA의 오염과 심​​각한 RNA 저하를 보여주는 목부 RNA 샘플.

그림 4
그림 4. 목부의 총 RNA의 애질런트 2100 electropherogram는 로블롤리 파인 목부에 설명된 방법을 사용하여 격리. 28S가 : 18S 비율은 1.4와 동일, RIN 값은 8.6와 동일

그림 5
그림 5. 애질런트 심각한 저하와 게놈 오염을 보여주는 혀끝의 팁 총 RNA의 2100 electropherogram. 28S가 : 18S 비율은 0.65와 동일, RIN 값은 3.4 동일

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Discussion

침엽수 종에서 고품질의 RNA를 구하기 우디 조직에서 발견 페놀 수지 carbon와 다당류 화합물의 높은 수준을 주어 어려운 작업이 될 수 있습니다. 장 외 개발한 프로토콜로 시작. (1), 우리는 더 엄격한 추출을 발견하고 침엽수 종의 다양한에서 샘플 다양한 우디 및 비 - 우디 조직에서 매우 높은 품질의 총 RNA의 일관된 고립으로 이어질 단계를 정리했습니다. 이 비디오는 우리 수정된 RNA 격리 프로토콜뿐만 아니라 필드 수집 및 절연 RNA하기 전에 로블롤리 파인에 사용되는 처리 기술에서 촬영된 단계뿐만 아니라 증명했다. 이러한 수확 및 준비 단계는 현장에서 수집된 샘플 RNA의 저하를 최소화하기 위해,뿐만 아니라 RNA의 품질과 총 생산량 모두 증가 똑같이 중요합니다. 가장 중요한, 우리는 RNA가 PtGen2 로블롤리 소나무 microarray (2)에 대한 하이브 리다이 제이션에 대한 microarray 목표를 준비하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 cDNA 합성 수율을 증가하게되었다이 방법을 사용하여 준비 것으로 나타났습니다.

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Acknowledgements

닥터 조 나이른, 매트 Bryman, 마이클 보르도, Ujwal Bagal, Huizhe 진, 아만다 Bouffier : 우리는 누구의 도움이 소나무 조직의 수집이 가능 않았을 텐데하지 않고 다음 사람에게 감사를 표합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA Isolation Buffer 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform Fisher Scientific C298-4
Phenol, Ultrapure Invitrogen 15509-037
10M LiCl Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0) 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. #05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. #05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes VWR international #21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL Thermo Fisher Scientific, Inc. #2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL Ambion #AM12425

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References

  1. Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11, (2), 113-116 (1993).
  2. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).

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