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विनोदी पाइन से एक शाही सेना के अलगाव की बेहतर विधि ( पी. taeda एल) और अन्य शंकुवृक्ष प्रजाति

Biology

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Summary

फ्लोएम और विनोदी पाइन से जाइलेम सहित कई संयंत्र के ऊतकों (

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Lorenz, W. W., Yu, Y., Dean, J. F. An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species. J. Vis. Exp. (36), e1751, doi:10.3791/1751 (2010).

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Abstract

Protocol

भाग 1: ट्री हार्वेस्ट

बाद पेड़ चयनित और felled है, यह महत्वपूर्ण है सावधानी के रूप में और जितना जल्दी संभव हो काम. प्रत्येक अलग ऊतक प्रकार के रूप में काटा जाता है, वे अपने स्वयं के तरल नाइट्रोजन वाहिकाओं में तुरंत रखा जाना चाहिए नमूना सामग्री के किसी भी पार संक्रमण से बचने. यह आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल स्केलेबल है.

  1. लगभग 0.5-0.75 मीटर की लंबाई में बोल्ट कट और एक chainsaw के स्कोर के साथ दो या तीन स्थानों में छाल बोल्ट के अनुदैर्ध्य अक्ष के बाद.
  2. एक लकड़ी छेनी का प्रयोग, बने क्षेत्र के किनारे काम जब तक छाल लकड़ी से अलग है और काम कर छेनी जबकि छाल की धारा पर वापस खींच जारी जब तक यह पूरी तरह स्टेम से अलग करने के लिए शुरू होता है.
  3. माध्यमिक जाइलेम सीधे बढ़त है कि छाल के छीन लिया गया है बोल्ट के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ scraping द्वारा एक तरफा उस्तरा के साथ काटा जाता है. लाटेकस दस्ताने पहनें करने के लिए ऊतक के प्रदूषण को कम.
  4. फ्लोएम, जो छाल वर्गों के भीतर की ओर पर स्थित है आसानी से छीलने के मैनुअल द्वारा काटा जाता है.
  5. रिएक्शन लकड़ी अंगों के नीचे से स्प्रे पेंट के साथ उन्हें अंकन जमीन सम्मान के साथ अपने मूल ओरिएंटेशन का संकेत के बाद एकत्र की है.
  6. अंग 1-2 मीटर की बोल्ट में कटौती कर रहे हैं और विपरीत पक्षों पर अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ प्रतिक्रिया की लकड़ी के दो प्रकार की अनुमानित स्थानों के अनुसार रन बनाए: विपरीत लकड़ी (अंग के ऊपर की ओर) और संपीड़न लकड़ी (तल पर अंग के पक्ष). छाल अंग के रूप में ऊपर वर्णित से अलग है, कि केवल प्रतिक्रिया लकड़ी के प्रत्येक प्रकार को कवर छाल एक समय में निकाल दिया जाता है, सिवाय. माध्यमिक जाइलेम या फ्लोएम तो के रूप में ऊपर वर्णित है और तरल नाइट्रोजन में रखा एकत्र है.
  7. सुइयों, गोली मार सुझावों और युवा शंकु के रूप में अन्य नमूनों, हाथ से काटा जा सकता है या pruning कैंची के रूप में की आवश्यकता का उपयोग.
  8. एकत्र तरल नाइट्रोजन में जमे हुए नमूने के रूप में चिह्नित बैग या उपयुक्त कंटेनर में रखा जाना चाहिए और लदान प्रयोगशाला के लिए वापस के लिए सूखी बर्फ में पैक.

भाग 2: फ्रीज़र नमूने मिल प्रसंस्करण

  1. तरल नाइट्रोजन के साथ Spex 6850 फ्रीजर मिल जलाशय भरें और पीस शीशियों में से एक में प्रभाव पट्टी जगह और पूर्व ठंडा करने तरल नाइट्रोजन के साथ भरें. तरल नाइट्रोजन डालो और शीशी नमूना जोड़ने.
  2. सुनिश्चित करें कि कोई अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन मिलिंग कक्ष में रहता है और है कि अधिक नाइट्रोजन गैस पूरी तरह से दिए है पहले अंत टोपी के लिए कक्ष को सील करने के लिए बैठा है बनाओ.
  3. वाहक और करीब में पीस शीशी डालें.
  4. 1 मिनट / चक्र के चक्र के लिए 14 की दर सेटिंग में दो मिल वुडी नमूने.
  5. एक बीकर है कि पूर्व ठंडा किया गया है और तरल नाइट्रोजन की एक छोटी राशि शामिल में milled नमूने (लकड़ी आटा) को हटाने के लिए एक तरल नाइट्रोजन ठंडा रंग का प्रयोग करें.
  6. एक भंडारण कंटेनर और जगह में -80 में तरल घोल / नाइट्रोजन नमूना डिग्री सेल्सियस जब तक जरूरत डालो.

भाग 3: शाही सेना अलगाव, दिवस 1

  1. एक 50ml छाया फाल्कन ट्यूब में शाही सेना अलगाव बफर के 20ml प्लेस और 400 μL संक्षिप्त β-mercaptoethanol भंवर, तो एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्मी जोड़ने.
  2. प्रत्येक ट्यूब जमी ऊतक के 4 ग्राम जोड़ें. कैप और 10 सेकंड के लिए vortexing द्वारा पीछा हाथ से सख्ती से हिला.
  3. ट्यूब को क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा में जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे पलटना. एक rotating पहिया पर ट्यूब प्लेस और अंत से अधिक के अंत 5 मिनट के लिए मिश्रण की अनुमति है.
  4. एक 50 एमएल ओक रिज और 12,000 (17,200 XG) SS34 5 मिनट के लिए निर्धारित कोण रोटर में आरपीएम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र में मिश्रण छानना.
  5. एक ताजा ओक रिज ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म की आधी मात्रा जोड़ने.
  6. 1 मिनट और 5 मिनट के लिए एक rotating पहिया पर मिश्रण जारी रखने के लिए भंवर. SS34 5 मिनट के लिए निर्धारित कोण रोटर में +१२,००० rpm (+१७,२०० XG) में अपकेंद्रित्र.
  7. ताजा ओक रिज ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म की आधी मात्रा जोड़ने. 1 मिनट के लिए भंवर. SS34 10 मिनट के लिए निर्धारित कोण रोटर में 12,000 rpm (17,200 XG) में अपकेंद्रित्र.
  8. एक 50 एमएल उच्च गति polypropylene ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण. SS34 20 मिनट के लिए निर्धारित कोण रोटर में 10,000 rpm (11,900 XG) अपकेंद्रित्र.
  9. 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में छानना सतह पर तैरनेवाला और एक चौथाई मात्रा 10 एम LiCl सतह पर तैरनेवाला का हल जोड़ें. संक्षेप में भंवर और 4 में जगह ° रात भर वर्षा के लिए सी.

भाग 4: शाही सेना अलगाव, 2 दिन

  1. एक 65 डिग्री सेल्सियस से पहले पानी शुरू करने के लिए स्नान में हीट SSTE बफर.
  2. एक polypropylene ट्यूब और गोली शाही सेना में एक SS34 तय कोण रोटर में 11,000 rpm (+१४,४५० XG) centrifugation द्वारा LiCl-उपजी नमूना 4 बजे 30 मिनट के लिए डालो डिग्री सेल्सियस
  3. Centrifugation के बाद,बंद डालना और तरल त्यागें, और लगभग 1 मिनट के लिए Kimwipes पर ट्यूबों पलटना. किसी भी शेष सतह पर तैरनेवाला पिपेट.
  4. गर्म एक विंदुक का उपयोग अच्छी तरह से नमूने मिश्रण SSTE के 800 μL में प्रत्येक गोली Resuspend. 2 एमएल Ambion RNase मुक्त microfuge ट्यूबों resuspended नमूना स्थानांतरण.
  5. हीट नमूने 65 में डिग्री सेल्सियस 2 जोरदार vortexing द्वारा पीछा करने के लिए पूरा resuspension सुनिश्चित मिनट के लिए.
  6. Phenol के क्लोरोफॉर्म, PH8 के एक बराबर मात्रा में प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए, जोड़ें. 30 सेकंड के लिए प्रत्येक नमूना भंवर और तब 3 मिनट के लिए 14,000 rpm पर एक microfuge में स्पिन
  7. एक नए 2ml Ambion RNase मुक्त microfuge ट्यूबों के लिए जलीय चरण स्थानांतरण, और क्लोरोफॉर्म की एक बराबर मात्रा में जोड़ें. 30 सेकंड और 3 मिनट के लिए 14,000 rpm पर microfuge में स्पिन के लिए प्रत्येक नमूना भंवर.
  8. चरण बंद जेल ट्यूब है कि पहले 2 मिनट के लिए 11,000 rpm पर microfuging द्वारा तैयार किया गया है जलीय चरण स्थानांतरण. क्लोरोफॉर्म की आधी मात्रा में जोड़ें और धीरे मिश्रण विंदुक.
  9. 5 मिनट के लिए 11,000 rpm पर अपकेंद्रित्र और ताजा 2ml Ambion RNase मुक्त microfuge ट्यूबों जलीय चरण हस्तांतरण.

भाग 5: शाही सेना वर्षा और इथेनॉल धो

  1. 50 μL 3.0 एम सोडियम एसीटेट, 4.8 पीएच, और 1 एमएल 100% जलीय चरण के लिए इथेनॉल जोड़ें. भंवर और -80 में वेग ° -20 पर 30 मिनट या रात भर के लिए सी डिग्री सेल्सियस
  2. 4 में 30 मिनट के लिए 14,000 rpm ° सी, और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate Microfuge नमूने हैं. गोली परेशान मत करो.
  3. 1 एमएल -20 इथेनॉल डिग्री सेल्सियस% 70 (v / v) के साथ शाही सेना छर्रों धो लें. 1 मिनट के लिए 14,000 rpm पर Microfuge और बंद इथेनॉल aspirate.
  4. 5.3 कदम दोहराएँ.
  5. 3-5 मिनट के लिए बेंच पर ट्यूब और हवा शुष्क छर्रों का खुलना.

भाग 6: अंतिम Resuspension और मात्रा

  1. 100 μL DEPC इलाज पानी में प्रत्येक गोली Resuspend. Vortexing द्वारा मिक्स और 65 ° सी में बर्फ पर रखने से पहले 2 मिनट के लिए ट्यूबों को सेते हैं. दोहराएँ अगर नमूना resuspension सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है.
  2. अगर वांछित और 10mm Tris, 7.5 पीएच में 1:10 कमजोर पड़ने की 50 μL spectrophotometric quantitation के लिए, बनाने के नमूने की तरह पूल. 260/280 और 260/230 के लिए absorbance अनुपात आम तौर पर कर रहे हैं अधिक से अधिक 2.1 और 2.2, क्रमशः. शाही सेना अलगाव पैदावार रेंज से 60 120μg / छ जमी ऊतक.
  3. एक 1% agarose जेल पर TAE बफर में 1.5-2.5 μg शाही सेना चलाकर नमूने का विश्लेषण. अधिक महत्वपूर्ण नमूने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Agilent Bioanalyzer 2100 का उपयोग शाही सेना का विश्लेषण.

प्रतिनिधि परिणाम:

आरएनए अलग शंकुवृक्ष ऊतकों रेंज से अलगाव की पैदावार 60-120 से μg / वुडी नमूनों के साथ जी जमी ऊतक आमतौर पर 70-80g / छ जमी ऊतक के आसपास उपज. 260/280 और 260/230 के डायग्नोस्टिक अनुपात दोनों कर रहे हैं आमतौर पर 2.1 की तुलना में अधिक है, और अच्छे संकेतक हैं कि शाही सेना किसी भी महत्वपूर्ण phenolic या कार्बोहाइड्रेट संदूषण से मुक्त नमूना है, क्रमशः. EtBr धुंधला के बाद agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण नमूने 25S, 18s, और 5S शाही सेना (चित्रा 1) के लिए तीन अलग - अलग बैंड दिखाने चाहिए. Agarose जैल पर 18s के लिए 28S के stoichiometry निर्धारण कुछ हद तक व्यक्तिपरक है, और जेल, धुंधला हो जाना, और नमूना लोड के लिए शर्तों चल रहा है जैसे कारकों एक प्रभाव हो सकता है. सामान्य, 28S में: 18s अनुपात> 1.5 के लिए दिखाई देगा. हालांकि, कुछ शंकुवृक्ष नमूने कम अनुपात है. उदाहरण के लिए, Agilent 2100 विश्लेषण के बाद हम विभिन्न प्रकार के ऊतकों जहां stoichiometry 1.2:1 के लिए करीब से शंकुवृक्ष नमूने के कई उदाहरण देखा है. इस प्रकार, एक स्पष्ट कम 28S: 18s agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा stoichiometry जरूरी गरीब गुणवत्ता एक नमूना संकेत नहीं करता है. पत्ता, शूटिंग, और शंकु नमूने अक्सर अतिरिक्त chloroplastic ribosomal RNAs के लिए अलग बैंड कारण वर्तमान. EtBr से सना हुआ सामग्री है कि अच्छी तरह से नमूना या उच्च आणविक जन बैंड (> 8-10 केबी) से विस्थापित नहीं करते आमतौर पर जीनोमिक डीएनए संदूषण (चित्रा 2) से संकेत मिलता है. कम या नीचे 5S बैंड और कम ribosomal बैंड धुंधला हो जाना या एक स्पष्ट 18s> 28S stoichiometry एक अच्छा संकेत है कि शाही सेना गिरावट हुई है (चित्रा 3) आसपास के क्षेत्र में आणविक जन स्मीयरों. Agilent 2100 electropherogram विश्लेषण, बेस लाइन कम और अपेक्षाकृत चिकनी प्रमुख 18s और 28S ribosomal 28S होने RNAs इसी चोटियों के साथ होना चाहिए: 18s अनुपात 1.2 से 2.0 करने के लिए कहीं भी लेकर. Agilent आरएनए वफ़ादारी (RIN) संख्या मान शाही सेना गुणवत्ता के एक बेहतर भविष्यवक्ता हो सकता है और कम से कम 7 या शाही सेना के लिए अधिक से अधिक है कि माइक्रोएरे लक्ष्य की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है होना चाहिए सकता है. चित्रा 4 28S साथ जाइलेम शाही सेना के लिए एक ठेठ Agilent 2100 electropherogram से पता चलता है: 18s 18s: 1.4 करने के लिए बराबर अनुपात और 8.6 का एक RIN मूल्य जबकि 5 चित्रा एक गरीब शाही सेना तैयार करने का एक बहुत ही उच्च आधारभूत और नजर गिरावट होने के रूप में 28S से पता चला जाइलेम से पता चलता है ra0.65 और 3.4 का एक RIN मूल्य के बराबर tio.

चित्रा 1
चित्रा उच्च गुणवत्ता पाइन शाही सेना के 1. Agarose जेल विश्लेषण. 1 लेन, ठोंग 1 केबी मानक, 2 लेन एक विशिष्ट विशेषता ribosomal 28S, 18s, और 5S बैंड और स्पष्ट 28S के साथ विनोदी पाइन माध्यमिक जाइलेम से कुल शाही सेना अलगाव से पता चलता है: 18s अनुपात> 1.

चित्रा 2
चित्रा 2. पाइन आरएनए नमूना के agarose जेल विश्लेषण जीनोमिक डीएनए के साथ दूषित है. लेन 1, ठोंग 1 केबी मानक, 2 लेन, जाइलेम शाही सेना जीनोमिक डीएनए संदूषण दिखा नमूना.

चित्रा 3
चित्रा 3. पाइन नमूना दिखा आरएनए गिरावट और जीनोमिक डीएनए के साथ संदूषण का agarose जेल विश्लेषण . 1 लेन, ठोंग 1 केबी मानक, Lane2, जाइलेम शाही सेना जीनोमिक डीएनए संदूषण और गंभीर आरएनए गिरावट दिखा नमूना.

चित्रा 4
चित्रा 4 Agilent 2100 electropherogram जाइलेम कुल शाही सेना के विनोदी पाइन जाइलेम पर वर्णित विधि का उपयोग पृथक. 28S: 18s अनुपात 1.4 के बराबर है, RIN मूल्य 8.6 के बराबर होती है

चित्रा 5
चित्रा 5 Agilent के शिखर टिप कुल गंभीर गिरावट और जीनोमिक प्रदूषण दिखा शाही सेना के 2100 electropherogram. 28S: 18s अनुपात 0.65 के बराबर है, RIN मूल्य 3.4 के बराबर होती है

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Discussion

शंकुवृक्ष प्रजातियों से प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए phenolic और polysaccharide वुडी ऊतकों में पाया यौगिकों के उच्च स्तर को देखते हुए एक मुश्किल काम हो सकता है. चांग एट अल द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के साथ शुरू. (1), हम है कि अधिक कठोर निष्कर्षण पाया है और विभिन्न वुडी और गैर - वुडी ऊतकों शंकुवृक्ष प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से नमूना से बहुत उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना के लगातार अलगाव के लिए नेतृत्व चरणों साफ. यह वीडियो न केवल हमारे संशोधित आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल, लेकिन यह भी क्षेत्र के संग्रह और विनोदी पाइन के लिए पहले प्रयोग किया जाता अलगाव शाही सेना प्रसंस्करण तकनीकों में उठाए गए कदमों का प्रदर्शन किया है. इन कटाई और तैयारी चरणों का समान रूप से महत्वपूर्ण हैं क्षेत्र एकत्र नमूनों में शाही सेना क्षरण कम से कम, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों शाही सेना गुणवत्ता और कुल उपज में वृद्धि. सबसे महत्वपूर्ण, हमने पाया है कि इस विधि का उपयोग शाही सेना के लिए अन्य तरीकों PtGen2 विनोदी सनोबर माइक्रोएरे (2) के खिलाफ संकरण के लिए माइक्रोएरे लक्ष्य तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया की तुलना में सीडीएनए संश्लेषण की पैदावार में वृद्धि हुई नेतृत्व तैयार है.

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Acknowledgements

डा. जो Nairn, मैट Bryman, माइकल बोर्डो, Ujwal Bagal, Huizhe जिन, और अमांडा Bouffier: हम बिना निम्नलिखित व्यक्तियों जिनकी मदद पाइन ऊतकों के संग्रह संभव नहीं होता को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA Isolation Buffer 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform Fisher Scientific C298-4
Phenol, Ultrapure Invitrogen 15509-037
10M LiCl Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0) 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. #05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. #05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes VWR international #21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL Thermo Fisher Scientific, Inc. #2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL Ambion #AM12425

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References

  1. Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11, (2), 113-116 (1993).
  2. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).

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