収穫精子とマウスの人工授精

Biology

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Summary

このプロトコルは、男性の精巣から精子を抽出し、雌マウスをinseminatingための方法を示しています。正確な時間が発生試験と同様にトランスジェニック作業に必要な場合にこの手順が便利です。

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice. J. Vis. Exp. (3), e184, doi:10.3791/184 (2007).

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Abstract

属のPeromyscus(鹿のマウス)のげっ歯類では最も普及しているネイティブの北米の哺乳動物です。 Peromyscus種は毒性学、疫学、生態学、行動、および遺伝学的研究を含む研究の幅広い分野で使用されています。ここで彼らは、人工授精のデモンストレーションのための有用なモデルを提供しています。

ここに表示されるものと同様の方法では、以前にいくつかの鹿のマウスの研究で用いられてきた、まだ詳細なプロトコルが公開されていない。ここでは、人工授精の基本的な方法を示しています。このメソッドは、精巣上体および精管から精子を分離し、齧歯類から精巣を抽出伴います。今ミルクの混合物で成熟した精子は、、排卵の時に女性の生殖器に配置されます。受精は胚発生のタイミングを0日としてカウントされます。胚は、所望の時間の時点で取得して操作することができます。

人工授精は、正確な胚のタイミングを得るために重要なまたは困難なげっ歯類の用途に使用できます。このテクニックはすぐに交尾および/または交配が評価しにくい場合があります種または菌株(最もPeromyscusを含む)に不可欠です。さらに、人工授精は、発達の進行および/またはトランスジェニック作業のマッピングのいずれかで胚発生の正確なタイミングを提供します。受精が保証されているので、動物の減少数は、使用することができます。このメソッドは、Peromyscusシステムを促進するために不可欠であったが、うまくいけば同様に他の人の利益になる。

Protocol

人工授精

人工授精は、すべての女性が妊娠しますしていること可能性を高めるために、自然交配の代わりに使用されます。 2オス1個ごとに過排卵女性や発情期にあることが分かっている女性のために使用されていました。成熟した雄マウスからcaudaの複数形精巣上体は、9%のミルクの懸濁液中に配置され、18ゲージの針を使って開いてスライスしていた。精子は、数分間自由に泳ぐことを許可されており、その後上体が混合物から採取した。懸濁液を合流し、運動性の精子用顕微鏡を用いて評価した。鈍22ゲージ1 ½インチ長い針は、精子を管理するために使用された。 120 °の曲げ3 / 4 番目の針ダウン方法について置かれた。 0.05mls注射 - 針は曲げと0.025に膣にまで挿入した。アシスタントが適切な位置に女性を保持するために使用されている場合は、麻酔剤の使用は不要です。

準備

  1. 女性6 4人の男性を使用してください
  2. ビバリウムで男性を安楽死させる
  3. 粉ミルクから9%の牛乳の約5 mlを調製
  4. 小さなシャーレに1.5mlを入れ
  5. epididymusと輸精管を切り取る
  6. 9%の牛乳の1.5ミリリットルに入れ
  7. 2つの18ゲージの針を使用して、そして針と長いカッティングモーションを使用して、精子を放出するepididymusと輸精管を切り開く
  8. 組織の上に左を取り出し、顕微鏡で精子をチェック

注射

  1. 120 °の角度で鈍針を使用してください
  2. 手でマウスをホールドし、混合物を注入する。一人が保持していると注射が嫌いなら、二人は、使用することができます。これはプロシージャに影響を与える可能性があるか知っている人でとしてない麻酔は、使用すべきではありません。
  3. 雌あたりの精子/ミルクミックスの0.05ミリリットルを使用して

受信者の女性

  1. 受信者の女性の膣スミアを実行してください(この時点で受信者の女性は、発情前期/発情期になるはず)
  2. 5日目で発情期に達していない女性は、おそらく使用してはいけません

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Acknowledgements

私はげっ歯類の生殖に関するPeromyscus遺伝株式の彼の貴重な洞察のためのセンター、忍耐、そして知識からマイクデューイに感謝いたします。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-772-30
18 gauge needle Tool BD Biosciences 305195
Powdered milk Reagent Any Supplier
1 ml syringe Tool National Scientific Company S7510-1
Forceps Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14200-075
22 gauge blunt needle Tool Give to me

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Comments

15 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. The total magnification to do the AI is between 10-²0x depending on the user for basic dissection. The sperm can be seen at 400x

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2007 - 2:09 PM
  3. Hello Amanda!  Thank for this article. I d like if you can give me more information about the powered milk, and if there is any posibility of create "make in home" powered milk. Too , if you can please give me the aprox. milimeters that need introduce the nedlle into the vagina. You understand my english? Thank you. Carolina (from Buenos Aires, Argentina)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2008 - 9:09 AM
  4. Hi Carolina, The milk is a commercial powdered milk bought from a regular grocery store. I am not sure what it contains if you wanted to make it at home. A little less than 1 cm of the needle was inserted into the vagina for sperm delivery but if you want to test it...I would use a dead mouse to check the insertion length when making a new needle. Good luck Amanda  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2008 - 12:19 PM
  5. Would there be any difference in the dimention of the insemination needle for rats. Is there a non-invasive method of extracting sperm in rats. How can the vaginal smear indicate prŒstrus/estrus.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2008 - 2:28 AM
  6. I know it is been a while since you posted the video. But what is the success rate of this protocol? thanks Ming

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 11, 2008 - 11:45 AM
  7. Amanda, Our lab is just beginning to look into artificial insemination.  After watching your video and looking at a few other artificial insemination protocols, I have a couple of questions: (1) How to you assess or induce ovulation? (²) How do you induce pseudopregnancy? Thank you, Rob

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 2, 2009 - 6:02 PM
  8. Hola, respuesta para Robert Stiles, mira si tu problema es matar a los machos, lo que puedes hacer castrar a los animales, de esa manera no es necesario sacrificarlos. Por lo tanto puedes obtener los espermas necesarios sin sacrificar al animal.   Saludos desde México Roberto Lazzarini, Biologo experimental    

    Reply
    Posted by: Roberto L.
    January 29, 2009 - 8:45 PM
  9. Hy Amanda, I would like to know  some things: 1 - what is your success rate? ² - Do you use the vaginal tampon like described by LECKIE et al, 1973 (Biology of Reproduction, Vol 9, 4²0-4²5)? 3 - I tested the techinique using dye solution and, afterwards, I sacrified the female, but I didn't see any solution inside the uterus. Do you introduce the needle in the cervix (like in human intra-uterine insemination) or you just put the needle very closely to it. Because don't have how to have sure about introducing into the cervix, unless using a special speculus. Thank you Daniela  

    Reply
    Posted by: Daniela F.
    March 4, 2009 - 9:44 AM
  10. Please send me the full video of collection of sperm from mice. Because i could not able to see the full video content in my institution so send full video to my mail. thanking you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 1:18 AM
  11. Hi, please contact us at support@jove.com and we'll see what we can do.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 3:19 PM
  12. hi Amanda ,please Iwant a copy of the video and any related subjects if you can support them to me I will very gratful .
    with my regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2009 - 9:16 AM
  13. do you induce pseudopregnancy in the recipient female or do
    you literally just inject the donor sperm??
    If you induce how do you do this?
    What are the pregnancy rates like from using this AI?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 29, 2010 - 4:50 AM
  14. Hi dear Amanda, I want to collect semen from rat, but when I removed the seminal vesicles and I cut them, semen was coagulated immediately. . In fact I need a protocole for rat semen collection. Thanks for help.
    Ameneh immunology MS student

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 8:52 AM
  15. Good day maam! Can i ask the procedure how to extract the sperm form the cauda epididymis? thank you.

    Reply
    Posted by: jamee d.
    November 23, 2012 - 6:55 AM

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