Harvesting Sperma und künstliche Besamung von Mice

Biology

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Summary

Dieses Protokoll zeigt Methoden zur Gewinnung von Spermien aus den Hoden der Männchen und dann Besamung weiblichen Mäusen. Dieses Verfahren ist nützlich, wenn die genaue Zeit in entwicklungspsychologischen Studien sowie transgene Arbeit benötigt wird.

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice. J. Vis. Exp. (3), e184, doi:10.3791/184 (2007).

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Abstract

Nagetiere der Gattung Peromyscus (Reh-Mäuse) sind die am weitesten verbreitete Muttersprache in Nordamerika Säugetiere. Peromyscus Arten sind in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Toxikologie, Epidemiologie, Ökologie, Verhaltens-und genetischen Studien verwendet. Hier sind sie ein nützliches Modell für die Demonstrationen der künstlichen Besamung.

Methoden ähnlich denen hier angezeigten zuvor in mehrere Hirsche Maus-Studien verwendet wurde, noch keine detaillierten Protokoll veröffentlicht worden. Hier zeigen wir die grundlegende Methode der künstlichen Befruchtung. Dieses Verfahren beinhaltet das Extrahieren der Hoden aus dem Nagetier, dann Isolierung der Spermien aus dem Nebenhoden und Samenleiter. Die reifen Spermien, jetzt in einem Milch-Gemisch, werden in den weiblichen Genitaltrakt auf die Zeit des Eisprungs platziert. Die Befruchtung wird als Tag 0 für Timing der Entwicklung des Embryos gezählt. Embryonen können dann zur gewünschten Zeit-Punkt abgerufen und manipuliert werden.

Künstliche Befruchtung kann in einer Vielzahl von Nagetieren, wo genau Embryo Timing ist entscheidend, oder schwer zu bekommen verwendet werden. Diese Technik ist von entscheidender Bedeutung für Arten oder Stämme (darunter die meisten Peromyscus), die sich nicht paaren können sofort und / oder wo Paarung ist schwer zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die künstliche Besamung genaue Zeitpunkt für die Entwicklung des Embryos entweder in Abbildung Entwicklungsfortschritte und / oder transgene Arbeit. Reduzierte Anzahl von Tieren verwendet werden, da die Befruchtung gewährleistet ist. Diese Methode wurde entscheidend für die Förderung der Peromyscus System, und wird hoffentlich profitieren auch andere.

Protocol

Künstliche Befruchtung

Künstliche Befruchtung wird anstelle der natürlichen Paarung, um die Chancen, dass alle Frauen geworden sind wird schwanger zu erhöhen. 2 männliche wurde für alle 1 superovulierten Weibchen oder ein Weibchen bekannt, in Östrus verwendet werden. Die caudae Nebenhoden von reifen männlichen Mäusen wurden in einer 9% Milch Suspension gegeben und offen mit 18-Gauge-Nadel in Scheiben geschnitten. Das Sperma wurde erlaubt, sich frei zu schwimmen ein paar Minuten und dann den Nebenhoden wurden aus dem Gemisch entnommen. Die Suspension wurde mit einem Mikroskop für Zusammenfluss und beweglichen Spermien untersucht. Eine stumpfe 22 Gauge 1 ½ Zoll lange Nadel verwendet wurde, um die Spermien zu verwalten. A 120 °-Bogen war etwa 3 / 4 th dem Weg nach unten die Nadel gesetzt. 0.05mls injiziert - Die Nadel wurde in die Vagina bis zur Kurve und 0,025 eingesetzt. Wenn ein Assistent wird verwendet, um das Weibchen in die entsprechende Position zu halten, ist der Einsatz von Anästhetika nicht benötigt.

Vorbereitung

  1. Verwenden Sie 4 Rüden für 6 Frauen
  2. Euthanize Männchen das Vivarium
  3. Bereiten Sie ca. 5 ml 9% Milch aus Milchpulver
  4. Legen Sie 1,5 ml in kleine Petrischale
  5. Schneiden Sie die Nebenhoden und Samenleiter
  6. Legen Sie in 1.5ml von 9% Milch
  7. Mit zwei 18-Gauge-Nadel und mit langen Schneiden Bewegung mit Nadeln, aufschneiden der Nebenhoden und Samenleiter die Spermien Release
  8. Nehmen Sie links über Gewebe und prüfen Spermien unter dem Mikroskop

Injektion

  1. Verwenden Sie stumpfen Nadel bei 120 ° Winkel
  2. Halten Sie die Maus in der Hand und spritzen Mischung. Bei Unwohlsein mit einer Person, und die Injektion können zwei Personen genutzt werden. Keine Narkose sollte verwendet werden, da auf einer weiß, wie diese könnte das Verfahren zu beeinflussen.
  3. Verwenden Sie 0,05 ml der Spermien / Milch-Mix pro Weibchen

Empfänger Weibchen

  1. Sie Vaginalabstrich auf Empfänger Weibchen (bis zu diesem Zeitpunkt den Empfänger Weibchen sollten in Proöstrus / Östrus werden)
  2. Frauen, die nicht Östrus wurden von Tag 5 erreicht, sollten Sie vielleicht nicht verwendet

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Acknowledgements

Ich möchte Mike Dewey vom Peromyscus Genetic Stock Center für seine wertvolle Einblicke, Geduld und Wissen auf Nagetier-Reproduktion zu danken.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-772-30
18 gauge needle Tool BD Biosciences 305195
Powdered milk Reagent Any Supplier
1 ml syringe Tool National Scientific Company S7510-1
Forceps Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14200-075
22 gauge blunt needle Tool Give to me

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Comments

15 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. The total magnification to do the AI is between 10-²0x depending on the user for basic dissection. The sperm can be seen at 400x

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2007 - 2:09 PM
  3. Hello Amanda!  Thank for this article. I d like if you can give me more information about the powered milk, and if there is any posibility of create "make in home" powered milk. Too , if you can please give me the aprox. milimeters that need introduce the nedlle into the vagina. You understand my english? Thank you. Carolina (from Buenos Aires, Argentina)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2008 - 9:09 AM
  4. Hi Carolina, The milk is a commercial powdered milk bought from a regular grocery store. I am not sure what it contains if you wanted to make it at home. A little less than 1 cm of the needle was inserted into the vagina for sperm delivery but if you want to test it...I would use a dead mouse to check the insertion length when making a new needle. Good luck Amanda  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2008 - 12:19 PM
  5. Would there be any difference in the dimention of the insemination needle for rats. Is there a non-invasive method of extracting sperm in rats. How can the vaginal smear indicate prŒstrus/estrus.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2008 - 2:28 AM
  6. I know it is been a while since you posted the video. But what is the success rate of this protocol? thanks Ming

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 11, 2008 - 11:45 AM
  7. Amanda, Our lab is just beginning to look into artificial insemination.  After watching your video and looking at a few other artificial insemination protocols, I have a couple of questions: (1) How to you assess or induce ovulation? (²) How do you induce pseudopregnancy? Thank you, Rob

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 2, 2009 - 6:02 PM
  8. Hola, respuesta para Robert Stiles, mira si tu problema es matar a los machos, lo que puedes hacer castrar a los animales, de esa manera no es necesario sacrificarlos. Por lo tanto puedes obtener los espermas necesarios sin sacrificar al animal.   Saludos desde México Roberto Lazzarini, Biologo experimental    

    Reply
    Posted by: Roberto L.
    January 29, 2009 - 8:45 PM
  9. Hy Amanda, I would like to know  some things: 1 - what is your success rate? ² - Do you use the vaginal tampon like described by LECKIE et al, 1973 (Biology of Reproduction, Vol 9, 4²0-4²5)? 3 - I tested the techinique using dye solution and, afterwards, I sacrified the female, but I didn't see any solution inside the uterus. Do you introduce the needle in the cervix (like in human intra-uterine insemination) or you just put the needle very closely to it. Because don't have how to have sure about introducing into the cervix, unless using a special speculus. Thank you Daniela  

    Reply
    Posted by: Daniela F.
    March 4, 2009 - 9:44 AM
  10. Please send me the full video of collection of sperm from mice. Because i could not able to see the full video content in my institution so send full video to my mail. thanking you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 1:18 AM
  11. Hi, please contact us at support@jove.com and we'll see what we can do.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 3:19 PM
  12. hi Amanda ,please Iwant a copy of the video and any related subjects if you can support them to me I will very gratful .
    with my regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2009 - 9:16 AM
  13. do you induce pseudopregnancy in the recipient female or do
    you literally just inject the donor sperm??
    If you induce how do you do this?
    What are the pregnancy rates like from using this AI?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 29, 2010 - 4:50 AM
  14. Hi dear Amanda, I want to collect semen from rat, but when I removed the seminal vesicles and I cut them, semen was coagulated immediately. . In fact I need a protocole for rat semen collection. Thanks for help.
    Ameneh immunology MS student

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 8:52 AM
  15. Good day maam! Can i ask the procedure how to extract the sperm form the cauda epididymis? thank you.

    Reply
    Posted by: jamee d.
    November 23, 2012 - 6:55 AM

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