Le sperme de récolte et l'insémination artificielle des souris

Biology

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Summary

Ce protocole illustre des méthodes pour extraire le sperme des testicules des mâles et ensuite inséminer les souris femelles. Cette procédure est utile lorsque l'heure précise est nécessaire dans les études de développement ainsi que les travaux transgéniques.

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice. J. Vis. Exp. (3), e184, doi:10.3791/184 (2007).

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Abstract

Les rongeurs de l'Peromyscus genre (souris sylvestre) sont les plus répandus natif mammifères nord-américain. Peromyscus espèces sont utilisées dans un large éventail de recherche, y compris la toxicologie, l'épidémiologie, l'écologie, du comportement, et les études génétiques. Ici, ils fournissent un modèle utile pour les démonstrations de l'insémination artificielle.

Des méthodes similaires à celles affichées ici ont déjà été utilisées dans plusieurs études de souris sylvestres, mais aucun protocole détaillé a été publié. Ici nous démontrons la méthode de base de l'insémination artificielle. Cette méthode consiste à extraire les testicules du rongeur, puis à isoler les spermatozoïdes de l'épididyme et le canal déférent. Les spermatozoïdes matures, maintenant dans un mélange de lait, sont placés dans l'appareil génital de la femelle au moment de l'ovulation. La fertilisation est compté comme 0 jours pour la synchronisation du développement embryonnaire. Les embryons peuvent alors être récupérées au moment du point désiré et manipulés.

L'insémination artificielle peut être utilisé dans une variété d'espèces de rongeurs, où le calendrier exact est cruciale embryon ou difficiles à obtenir. Cette technique est vitale pour les espèces ou souches (y compris les plus Peromyscus) qui ne peut s'accouplent immédiatement et / ou lorsque l'accouplement est difficile à évaluer. En outre, l'insémination artificielle permet timing exact pour le développement de l'embryon, soit dans la cartographie des progrès de développement et / ou travaux transgéniques. Réduction du nombre d'animaux peut être utilisé depuis la fécondation est garanti. Cette méthode a été essentielle à la poursuite du système Peromyscus, et nous espérons bénéficier d'autres aussi.

Protocol

Insémination Artificielle

L'insémination artificielle est utilisée à la place d'accouplements naturels pour augmenter les chances que toutes les femelles ont deviennent enceintes. 2 mâles a été utilisé pour chaque 1 femelles superovulées ou une femelle connue pour être en oestrus. Les épididymes caudae de souris mâles matures ont été placés dans une suspension de lait de 9% et tranchées ouvertes avec 18 aiguilles de calibre. Le sperme a été autorisée à nager librement pendant quelques minutes puis les épididymes ont été prises à partir du mélange. La suspension a été évaluée avec un microscope pour confluence et les spermatozoïdes mobiles. Un émoussée de calibre 22 de 1 ½ pouce de long aiguille a été utilisée pour administrer le sperme. Un virage à 120 ° a été placé environ 3 / 4 ème de la descente de l'aiguille. L'aiguille a été insérée dans le vagin jusqu'à la courbure et 0,025 - 0.05mls injecté. Si un assistant est utilisé pour maintenir les femmes dans la position appropriée, l'utilisation d'anesthésiques n'est pas nécessaire.

Préparation

  1. Utilisez 4 mâles pour 6 femelles
  2. Euthanasier les mâles à le vivarium
  3. Préparer environ 5 ml de lait de 9% par du lait en poudre
  4. Mettez 1,5 ml en boîte de Petri petits
  5. Découpez l'épididyme et le canal déférent
  6. Mettre en 1.5ml de lait 9%
  7. L'utilisation de deux aiguilles de calibre 18, et en utilisant de longues mouvement de coupe avec des aiguilles, tranche ouverte l'épididyme et le canal déférent de libérer le sperme
  8. Prenez à gauche en sortant sur un tissu et vérifier les spermatozoïdes sous le microscope

Injection

  1. Utilisez une aiguille émoussée à 120 ° d'angle
  2. Maintenez la souris dans la main et injecter le mélange. Si à l'aise avec une personne qui détient et l'injection, deux personnes peuvent être utilisées. Pas d'anesthésie devrait être utilisée, comme le sait comment cela pourrait influer sur la procédure.
  3. Utiliser 0,05 ml de sperme / mélanger le lait par femelle

Femelles receveuses

  1. Ne le frottis vaginal des femelles receveuses (à cette époque l'femelles receveuses doivent être en proestrus / œstrus)
  2. Les femelles qui n'ont pas atteint l'oestrus par Jour 5 ne devrait probablement pas utilisés

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Acknowledgements

Je tiens à remercier Mike Dewey partir du Centre de stock génétique Peromyscus pour ses précieux renseignements, la patience et de connaissances sur la reproduction chez les rongeurs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-772-30
18 gauge needle Tool BD Biosciences 305195
Powdered milk Reagent Any Supplier
1 ml syringe Tool National Scientific Company S7510-1
Forceps Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14200-075
22 gauge blunt needle Tool Give to me

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Comments

15 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. The total magnification to do the AI is between 10-²0x depending on the user for basic dissection. The sperm can be seen at 400x

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2007 - 2:09 PM
  3. Hello Amanda!  Thank for this article. I d like if you can give me more information about the powered milk, and if there is any posibility of create "make in home" powered milk. Too , if you can please give me the aprox. milimeters that need introduce the nedlle into the vagina. You understand my english? Thank you. Carolina (from Buenos Aires, Argentina)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2008 - 9:09 AM
  4. Hi Carolina, The milk is a commercial powdered milk bought from a regular grocery store. I am not sure what it contains if you wanted to make it at home. A little less than 1 cm of the needle was inserted into the vagina for sperm delivery but if you want to test it...I would use a dead mouse to check the insertion length when making a new needle. Good luck Amanda  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2008 - 12:19 PM
  5. Would there be any difference in the dimention of the insemination needle for rats. Is there a non-invasive method of extracting sperm in rats. How can the vaginal smear indicate prŒstrus/estrus.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2008 - 2:28 AM
  6. I know it is been a while since you posted the video. But what is the success rate of this protocol? thanks Ming

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 11, 2008 - 11:45 AM
  7. Amanda, Our lab is just beginning to look into artificial insemination.  After watching your video and looking at a few other artificial insemination protocols, I have a couple of questions: (1) How to you assess or induce ovulation? (²) How do you induce pseudopregnancy? Thank you, Rob

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 2, 2009 - 6:02 PM
  8. Hola, respuesta para Robert Stiles, mira si tu problema es matar a los machos, lo que puedes hacer castrar a los animales, de esa manera no es necesario sacrificarlos. Por lo tanto puedes obtener los espermas necesarios sin sacrificar al animal.   Saludos desde México Roberto Lazzarini, Biologo experimental    

    Reply
    Posted by: Roberto L.
    January 29, 2009 - 8:45 PM
  9. Hy Amanda, I would like to know  some things: 1 - what is your success rate? ² - Do you use the vaginal tampon like described by LECKIE et al, 1973 (Biology of Reproduction, Vol 9, 4²0-4²5)? 3 - I tested the techinique using dye solution and, afterwards, I sacrified the female, but I didn't see any solution inside the uterus. Do you introduce the needle in the cervix (like in human intra-uterine insemination) or you just put the needle very closely to it. Because don't have how to have sure about introducing into the cervix, unless using a special speculus. Thank you Daniela  

    Reply
    Posted by: Daniela F.
    March 4, 2009 - 9:44 AM
  10. Please send me the full video of collection of sperm from mice. Because i could not able to see the full video content in my institution so send full video to my mail. thanking you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 1:18 AM
  11. Hi, please contact us at support@jove.com and we'll see what we can do.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 3:19 PM
  12. hi Amanda ,please Iwant a copy of the video and any related subjects if you can support them to me I will very gratful .
    with my regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2009 - 9:16 AM
  13. do you induce pseudopregnancy in the recipient female or do
    you literally just inject the donor sperm??
    If you induce how do you do this?
    What are the pregnancy rates like from using this AI?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 29, 2010 - 4:50 AM
  14. Hi dear Amanda, I want to collect semen from rat, but when I removed the seminal vesicles and I cut them, semen was coagulated immediately. . In fact I need a protocole for rat semen collection. Thanks for help.
    Ameneh immunology MS student

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 8:52 AM
  15. Good day maam! Can i ask the procedure how to extract the sperm form the cauda epididymis? thank you.

    Reply
    Posted by: jamee d.
    November 23, 2012 - 6:55 AM

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