플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

Biology

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Summary

플라스틱 부분은 조직의 여러 유형의 파라핀 - 임베디드 또는 냉동 부분보다이 방법이 더 유용하고, 형광 항체와 보조 immunostained 수있는 조직의 얇은 부분에서 진정한 조직 형태를 유지합니다. 얼룩, 플라스틱 포함하고, sectioning에 대한 방법은이 동영상에서 보여주입니다.

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Ogata, S., Kawauchi, S., Calof, A., Cho, K. W. Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (3), e188, doi:10.3791/188 (2007).

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Abstract

Protocol

정치

  1. (피셔 고양이 # 03-339 - 25B) 작은 유리 섬광 병에 MEMFA 또는 3.7 % FA + PBS로 전체 배아 또는 해부 explants을 전송합니다. 그것보다 더뿐만 아니라, 2 시간, RT에서 nutator에 병을 부화합니다. 2 시간 이상 FA에서 배아를 두지 마십시오. FA의 긴 배양은 배아 조직 어렵게하고 검색 과정에서 항체의 가난한 침투가 발생합니다.

  2. FA의 대부분을 기음과 유리병 (~ 4.5ml)의 상단에 덴트의 정착액을 추가합니다. 부드럽게 신선한 덴트의 다른 4.5ml과 덴트의에 교류를 배아를 씻어 몇 번 병을 반전하고, 적어도 48 시간 동안 -20 º C에서 알을 품다. 숙박 충분하지 않습니다. 이 단계는 항체에 대한 배아가 더 투과합니다. 배아는 몇 주 동안이 조건에 보관하실 수 있습니다.

Immunofluorescence

  1. 표본을 Rehydrate. 다음과 같이 메탄올의 등급 시리즈를 품어 :

    75% MeOH / H 2 O 10 분
    50% MeOH / PBS 10 분
    25% MeOH / PBS 10 분
    PBS 10 분
    PBS 10 분

  2. 60mm 플라스틱 요리와 1.5 % 아가로 오스 / PBS 번호판을 확인합니다. 그것이 고체 된 후 아가로 오스 위에 PBS 하거라.

  3. 배아의 헤미 - sectioning : 1.5 % 아가로 오스 / PBS 판에서 배아를 넣어. 포셉 한 쌍의있는 배아를 잡고 얇은 면도날을 사용하여 배아의 중심을 반으로 잘라. 당신이 성공적으로 직선 절단 평면과 반으로 가지고있는 사람을 선택합니다.

    그림 1

  4. PBT와 유리 섬광 약병에 bisected 배아를 전송합니다. 20 % 염소 혈청 + PBT의 4.5ml와 교류. nutator (차단) 2 시간 RT에서 알을 품다.

  5. PBT의 기본 항체의 적절한 희석을 준비합니다. 이 당 샘플 0.5ml이 필요합니다. 예를 들어, 나는 5mm 플라스틱 부분에서 C - cadherin의 subcellular 지방화를 연구하기 위해 토끼 안티 - C - cadherin PAB의 2백분의 1 희석를 사용합니다.

  6. 차단 솔루션을 기음과 희석 주 항체의 0.5ml를 추가합니다. 스티로폼 튜브 홀더에 서있는 위치에 튜브를 넣어. nutator 4 º C에서 밤새 품어.

  7. 희석 기본 항체 (이 희석 차 항체가 저장하고 다음 1~2주에 활용할 수 있습니다)를 제거합니다. RT 4 회 (40~60분 각)의 PBT의 4.5ml로 씻으십시오.

  8. PBT에서 비오틴 - 복합 이차 항체의 100분의 1 희석의 0.5ml와 교류. nutator 4 º C에서 밤새 품어. 빛과 비오틴을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 커버.

  9. 이 시점에서, 치료는 어떤 표지 또는 알루미늄 호일에서 튜브를 유지, 빛, 즉로부터 시료를 보호하기 위해 이동해야합니다.

  10. 비오틴 - 보조 항체 (이 또한 다음 1-2주에 활용할 수 있습니다)를 제거합니다. RT에서 (각 40-60분) 또는 4 회 대한 PBT의 4.5ml 씻으십시오.

  11. PBT에서 Streptavidin (FITC, 텍사스 - 빨강, 등) 찬란 - 라벨의 200분의 1 희석의 0.5ml와 교류. nutator 4 º C에서 밤새 품어.

  12. streptavidin을 (이것도 활용할 수 있습니다)를 제거합니다. RT에서 - (30 분 각 15) 3 회 대한 PBT의 4.5ml로 씻으십시오.

  13. RT 30 분 3.7 % FA + PBS의 4.5ml의 배아를 수정.

  14. 두 번 PBS의 4.5ml로 씻으십시오.

  15. 표본을 탈수. 다음과 같이 에탄올의 등급 시리즈를 품어 :

    30% EtOH / H 2 O 10 분
    50% EtOH / H 2 O 10 분
    75% EtOH / H 2 O 10 분
    백퍼센트 EtOH 10 분


  16. 표본은 빛으로부터 그것을 보호하기 위해 커버 4 개 º C 100 % EtOH에 저장할 수 있습니다.

침투

  1. Technovit 7,100 침투 믹스를 확인하십시오. 나는 보통 50ml 원뿔 튜브 기본 액체 15ml 받아를 경화제의 150mg 추가하고 15 분 동안 nutator에 락을하여 섞는다. 이 침투 믹스는 최대 1 개월 4 ° C에 보관하실 수 있습니다.

  2. Technovit의 침투 믹스 / EtOH 콤보의 등급 일련의 교환에 의해 침투 믹스로 표본을 침투로 다음과 :

    1. 50% Technovit / EtOH - 1시간

    2. 100 % Technovit - 1시간

    3. 100 % Technovit - 하룻밤

  3. specimeN 4 º C.에 1 개월에 대한 100 % 침투 믹스에 저장할 수 있습니다 빛을에서 그들을 보호하기 위해 샘플에 덮개를 넣어.

퍼가기

  1. Technovit 7100 포함 믹스를 만들기 : 1.5ml 튜브에 침투 믹스의 0.75ml을 가지고 경화제 II의 50ml를 추가합니다. 반전 튜브를 여러 번하여 섞는다.

  2. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 하나의 표본이 0.5ml 얇은 벽 PCR 튜브에 하룻밤에 침투 가져가라. 뜨는의 대부분을 제거합니다.

  3. 표본이 섹션의 단계 # 1, "퍼가기"에서 만든 포함 믹스의 0.25ml를 추가합니다. 동양 부드럽게 재미 - 팁 해부 니들 (해부 바늘 나무 - 핸들)을 이끌어하여 튜브의 바닥에 마주 절개의 비행기를 만들기 위해 bisected 배아.

  4. 뚜껑을 닫고 비닐은 중합 수 있도록 약 4 시간 동안 어두운 장소에서 튜브를 품어.

  5. Technovit 3,040 믹스를 확인하십시오. 계량 접시에 분말 1g을 가지고, 액체 0.5ml를 추가합니다. 즉시 bluetip를 사용하여 분말 및 액체를 섞는다. 강화된 spacimen 위에 부어. 이 노란색 Technovit 3040은 튜브에서 나오는에서 전체 플라스틱 블록을 방지할 수 있습니다.

Sectioning

  1. 크실렌과 Histoknife H 닦아 (EtOH 자주 충분하지 않습니다) 및 마이크로톰에 설정합니다. 약 45 °의 칼날을 각도. 이 지역의 청결은 sectioned 조각의 품질에 중요하기 때문에, 너무, 크실렌과 블레이드의 전면에 무대 영역을 닦아주십시오.

  2. 튜브의 측면을 잘라 골판지 나이프를 사용하여 해제 팁 껍질.

    그림 2

  3. 마이크로톰의 척 홀더로 표본을 설정합니다.

  4. 섹션 슬라이스에 마운트 챔버를 만들기 위해 슬라이드 유리에 "언론 - 투 - 인감"실리콘 절연체를 부착합니다. 단단히 깨끗한 benchtop에있는 슬라이드에 절연체를 눌러 절연체가 완전히 다른 공기 방울없이 연결되었는지 확인하기 위해 반대편에서보세요. 최대가 물의 표면, 평면 오목되지 않거나 모양으로 볼록이된다고 볼 수있는 수준으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에있는 수영장에 깨끗하고 따뜻한 DH 2 O를 (~ 40 ° C) 하거라.

  5. 섹션 조각 만들기 시작합니다. immunofluorescence 연구, 나는 5mm 섹션 조각합니다. 목적과 신호의 농도에 따라 8mm - 현장 하이브리드화 샘플의 경우, 슬라이스의 두께는 ~ 3의 범위에서 조정할 수 있습니다.

  6. 작은 페인트 브러쉬를 사용하여, 블레이드의 앞 단계에서 물을 장착 챔버에 섹션 조각 운반. 워터 풀 위에 슬라이스로 페인트 잡고 재미 - 팁 해부 바늘로 두드리는하여 물을 슬라이스 드롭 다운. 그것은 물의 표면을 안타로 슬라이스는 곧 둥근 모양으로 확장됩니다.

  7. 대부분의 장착 챔버의 수면 면적이 섹션 슬라이스가 가득하면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 물을 거의 절반까지 빨아. 샘플 완전히 건조하기 위해 슬라이드 따뜻한 하룻밤에 슬라이드를 품어.

  8. 5 분 동안 DAPI (TE에 0.1mg/ml)의 1ml와 카운터 얼룩. 기음 DAPI는 예제를 건조.

  9. 슬라이드에서 실리콘 고무 절연체를 제거합니다. 이제 사진은 샘플 촬영하실 수 있습니다. 4 샘플을 보관 ° 빛으로부터 보호 C를.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS Buffer 1L recipe8.0gNaCl0.2gKCl2.68gNa2HPO4·7H2O0.2gKH2PO4The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1L. Autoclave.
PBT Buffer Add 0.5ml of Triton X-100 and 1.0g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative Reagent Mix 40ml of methanol and 10ml of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS Reagent Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat Ab Vector Laboratories BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat Ab Vector Laboratories BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT Ab Invitrogen ALI3409 BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse Ab Invitrogen M30115 CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit Reagent Vector Laboratories SA-1200 Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT Buffer This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush Tool
Dull-tip dissection needle Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040 Reagent 7100 GMA , 3040 glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H Tool Energy Beam Sciences H1310
75% MeOH/H2O Buffer
50% MeOH/PBS Buffer
25% MeOH/PBS Buffer
30% EtOH/H2O Buffer
50% EtOH/H2O Buffer
75% EtOH/H2O Buffer
100% EtOH Buffer
Small glass scintillation vials Tool Fisher Scientific 03-339-25B
0.5ml Thin-wall PCR tubes Tool Molecular BioProducts 3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators Tool Grace Bio-Lab Inc. JTR1L-2.5 32mm L x 19mm W, 2.5mm D
Thin razor blade Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.

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Comments

1 Comment

  1. So what are the advantages of plastic sectioning over frozen/wax embedding + sectioning?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 11:13 AM

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