Plast inbäddning och Sektionering av Xenopus laevis embryon

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Plast sektioner upprätthålla sant vävnad morfologi i tunna delar av vävnad som kan immunostained med fluorescerande sekundära antikroppar, vilket gör denna metod mer användbar än paraffininbäddade eller frysta snitt för många typer av vävnad. Metoden för färgning, plast inbäddning och snittning visas i denna video.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ogata, S., Kawauchi, S., Calof, A., Cho, K. W. Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (3), e188, doi:10.3791/188 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Fixering

  1. Överför hela embryon eller dissekeras explants i MEMFA eller 3,7% FA + PBS i ett litet glas scintillation injektionsflaska (Fisher katt # 03 till 339-25B). Inkubera flaskan på nutator vid RT, endast för 2 timmar och inte mer än så. Lämna inte embryo i FA för mer än 2 timmar. Längre inkubation i FA kommer att göra embryonal vävnad hårdare och resultera i en dålig penetration av antikroppar i identifieringsprocessen.

  2. Aspirera flesta av FA och lägga Dent är fixativ upp till toppen på flaskan (~ 4,5 ml). Vänd försiktigt injektionsflaskan några gånger för att tvätta embryon i Dent-talet, utbyte med en annan 4,5 ml av färsk Dent-talet, och inkubera det i -20 º C i minst 48 timmar. Övernattning är inte tillräckligt. Detta steg gör att embryon mer genomsläpplig för antikroppen. Embryon kan förvaras i detta tillstånd i flera veckor.

Immunofluorescens

  1. Rehydrera provet. Inkubera i en graderad serie av metanol, enligt följande:

    75% MeOH / H 2 O 10min
    50% MeOH / PBS 10min
    25% MeOH / PBS 10min
    PBS 10min
    PBS 10min

  2. Gör 1,5% agaros / PBS plåtar med 60mm plastskålar. Häll PBS ovanpå agarosen efter att det har blivit fast.

  3. Hemi-sektionering av embryon: Sätt embryona i en 1,5% agaros / PBS tallrik. Ta ett embryo med en pincett och skär den i två halvor genom centrum av embryo med hjälp av en tunn rakblad. Välj de som du har lyckats halvera med en rak skärande plan.

    Figur 1

  4. Överför tudelas embryon i ett glas scintillation injektionsflaska med PBT. Exchange med 4,5 ml av 20% get serum + PBT. Inkubera vid RT för 2 timmar på en nutator (blockering).

  5. Bered en lämplig spädning av den primära antikroppen i PBT. 0,5 ml av denna per prov behövs. Till exempel använde jag 1 / 200 utspädning av kanin anti-C-cadherin pAb att studera subcellulära lokalisering av C-cadherin i 5mm plast avsnitt.

  6. Sug den blockerande lösningen och tillsätt 0,5 ml av den utspädda primära antikroppen. Lägg rören i stand-up position på en frigolit rörhållare. Inkubera över natten vid 4 º C på en nutator.

  7. Ta bort den utspädda primära antikroppen (detta utspädd primär antikropp kan sparas och återanvändas i nästa 1-2 veckor). Tvätta med 4,5 ml av PBT för 4 gånger (40-60 minuter) vid RT.

  8. Exchange med 0,5 ml 1 / 100 utspädning av Biotin-konjugerade sekundära antikroppar i PBT. Inkubera över natten vid 4 º C på en nutator. Täck rören med aluminiumfolie för att skydda biotin från ljus.

  9. Från denna punkt, skall försiktighet vidtas för att skydda provet från ljus, dvs hålla flaskorna under några lock eller aluminiumfolie.

  10. Ta bort Biotin-sekundär antikropp (detta kan också återanvändas i nästa 1-2 veckor). Tvätta med eller 4,5 ml av PBT för 4 gånger (40-60 minuter) vid RT.

  11. Exchange med 0,5 ml 1 / 200 utspädning av fluorescerande-(FITC, Texas-röd etc.) Streptavidin i PBT. Inkubera över natten vid 4 º C på en nutator.

  12. Ta bort streptavidin (detta kan återanvändas, också). Tvätta med 4,5 ml av PBT för 3 gånger (15 - 30 minuter) vid RT.

  13. Fix embryona i 4,5 ml av 3,7% FA + PBS i 30 minuter vid RT.

  14. Tvätta med 4,5 ml PBS två gånger.

  15. Torka provet. Inkubera i en graderad serie av etanol, enligt följande:

    30% EtOH / H 2 O 10 min
    50% EtOH / H 2 O 10 min
    75% EtOH / H 2 O 10 min
    100% EtOH 10 min


  16. Provet kan förvaras i 100% EtOH vid 4 º C med ett lock för att skydda den mot ljus.

Infiltration

  1. Gör Technovit 7100 infiltration mix. Jag brukar ta 15ml av basen vätska i ett 50 ml koniskt rör, lägga 150mg härdare jag och blanda det med gunga på en nutator i 15 minuter. Denna infiltration mix kan hållas vid 4 ° C i upp till en månad.

  2. Infiltrera provet med infiltration blandningen genom att byta med en graderad serie av Technovit infiltration mix / EtOH combo, enligt följande:

    1. 50% Technovit / EtOH - 1 timme

    2. 100% Technovit - 1 timme

    3. 100% Technovit - över en natt

  3. Den specimen kan lagras i 100% infiltrationen blanda i upp till en månad vid 4 º C. Sätt ett lock på proverna för att skydda dem från ljus.

Bädda in

  1. Gör Technovit 7100 bädda mix: Ta 0.75ml av infiltration blanda i ett 1,5 ml rör och tillsätt 50ml härdare II. Blanda genom att vända röret flera gånger.

  2. Använd en plast överföringspipett, ta ett prov infiltrerade övernattning i 0.5ml tunnväggiga PCR-rör. Ta bort större delen av supernatanten.

  3. Tillsätt 0.25ml av inbäddning mixen gjorde i steg # 1 i detta avsnitt, "Bädda in", till provet. Rikta in tudelas embryot att göra dissekering planet står inför till botten av röret, genom att försiktigt knuffa med en dov spets dissektion nål (trä-handtag dissektion nål).

  4. Stäng locket och inkubera röret i en mörk plats i ca fyra timmar så att plasten polymerisera.

  5. Gör Technovit 3040 mix. Ta 1 gram av pulvret till en vågskål, och tillsätt 0,5 ml av vätskan. Omedelbart, blanda pulver och vätska med en bluetip. Häll ovanpå härdade spacimen. Denna gula Technovit 3040 kommer att förhindra att hela plasten blocket kommer ut från röret.

Sektionering

  1. Torka Histoknife H med xylen (EtOH är ofta inte tillräckligt bra) och ställ den på din mikrotomen. Vinkla bladet vid ca 45 °. Torka scenen området framför bladet med xylen också, eftersom renhet av detta område är avgörande för kvaliteten i sektionerade skivor.

  2. Skär sidan av röret och dra av spetsen med en kartong kniv.

    Figur 2

  3. Ställ in prov i chucken innehavaren av mikrotomen.

  4. Fäst en "press-to-tätning" kisel isolator på en bild glas för att göra ett montage kammare för avsnitt skivor. Ordentligt tryck på isolator på glaset på rena bänk och titta från andra sidan att se till att isolatorn är ordentligt utan luftbubblor. Häll rent och varmt dH 2 O (~ 40 ° C) till poolen på bilden med hjälp av en pasteurpipett, upp till den nivå där den kan man se att vattenytan blir platt, inte konkav eller konvex form.

  5. Börja göra avsnitt skivor. För immunofluorescens studier, gör jag 5 skivor mm avsnitt. För in situ hybridisering prover kan tjockleken på skivorna justeras i intervallet ~ 3 - 8 mm, beroende på syfte och intensiteten hos signalerna.

  6. Bär avsnittet skivor från scenen framför bladet till montering kammaren med vatten, med en liten pensel. Håll pensel med en skiva ovanpå vattnet poolen och släpper skiva ned till vattnet genom att slå den med en dov spets dissektion nål. Segmentet kommer att expandera i en rund form så snart det träffar vattenytan.

  7. När de flesta av vattnet yta montering kammaren är fylld med avsnitt skivor, suga upp nästan hälften av vattnet med en pasteurpipett. Inkubera bilden på en bild varmare över natten för att göra provet helt torr.

  8. Counter-fläcken med 1 ml DAPI (0.1mg/ml i TE) i fem minuter. Aspirera DAPI och torra provet.

  9. Ta bort isolatorn silikongummi från bilden. Nu bilder kan tas av provet. Förvara provet vid 4 ° C, skyddat från ljus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS Buffer 1L recipe8.0gNaCl0.2gKCl2.68gNa2HPO4·7H2O0.2gKH2PO4The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1L. Autoclave.
PBT Buffer Add 0.5ml of Triton X-100 and 1.0g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative Reagent Mix 40ml of methanol and 10ml of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS Reagent Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat Ab Vector Laboratories BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat Ab Vector Laboratories BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT Ab Invitrogen ALI3409 BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse Ab Invitrogen M30115 CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit Reagent Vector Laboratories SA-1200 Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT Buffer This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush Tool
Dull-tip dissection needle Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040 Reagent 7100 GMA , 3040 glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H Tool Energy Beam Sciences H1310
75% MeOH/H2O Buffer
50% MeOH/PBS Buffer
25% MeOH/PBS Buffer
30% EtOH/H2O Buffer
50% EtOH/H2O Buffer
75% EtOH/H2O Buffer
100% EtOH Buffer
Small glass scintillation vials Tool Fisher Scientific 03-339-25B
0.5ml Thin-wall PCR tubes Tool Molecular BioProducts 3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators Tool Grace Bio-Lab Inc. JTR1L-2.5 32mm L x 19mm W, 2.5mm D
Thin razor blade Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

1 Comment

  1. So what are the advantages of plastic sectioning over frozen/wax embedding + sectioning?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 17, 2008 - 11:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics