组织测定动物第移植(ACT)的含量非洲爪蟾

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

动物帽高表达的基因产物(S)移植到发展中国家的侧翼

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

许多蛋白质​​在胚胎发育中发挥的双重作用。那些规范在一个特定的组织细胞命运决定的,也可以影响的一个较大区域的胚胎的发展。这使得确定其在一个特定的组织中的作用难以分析。例如,

Protocol

第一部分设置为ACT检测

  1. 生成皑皑的RNA注射制造商的建议,使用他们的酚:氯仿纯化方法(如mMessage mMachine套件;美国应用生物系统公司/ Ambion公司,奥斯汀,德克萨斯)。 RNA的编码一种荧光蛋白作为示踪。我们抄录或者黄色荧光蛋白(YFP)或mCherry 5基因,这是在pCS2 +表达载体。
  2. 拉硼硅玻璃毛细管形成锥形玻璃提示,使用微量拉马。我们使用萨特微管牵引器,P - 97(萨特仪器公司,诺瓦托,CA),如前面所述6。
  3. 表1无菌解决方案,从一个10 X马克的修改林格的疫苗(MMR)解决方案的股票(10 mM的MgCl 2的20 mM的氯化钾; 20 mM 氯化钙; 50 mM的HEPES; 1中号氯化钠;调整pH值7.5,高压灭菌,并储存在RT)。
  4. 隔离从一个男性的青蛙睾丸和组织1X MMR /庆大霉素(50微克/毫升硫酸庆大霉素; BioWhittaker,猫#17 - 518Z)在无菌溶液保存在4 ° C。这可以在实验开始前的一个星期,但它是失去时间的推移其疗效。
  5. 产蛋的解决方案(1X:2.62 mM的氯化钾,氯化钠150毫米,0.8毫米的Na 2 HPO 4 Trizma基地,20毫米,2.62 毫米碳酸氢钠3,2.75毫米硫酸镁;调整pH至7.6),可作为8X股票,这可以保存在4 ° C为两个星期。 注意 :要注意在这一解决方案的污染,因为这会影响鸡蛋的质量。
  6. 生成注入板块。要做到这一点,在0.4X在微波炉MMR中熔化1%琼脂糖,加入到60毫米板〜6毫升熔化的琼脂糖溶液,轻轻解开一个弹性模具上顶级的解决方案,以防止泡沫,让凉爽约(图1)在室温下20分钟。要确定所需的数量,考虑实验条件( 例如:1,YFP的; 2,YFP + Noggin)和需要移植的主机胚胎数量。对于我们的实验中,我们为每个实验条件下产生至少20移植的主机胚胎。在18-19℃,胚胎将在阶段15,约一个小时。如果需要一小时进行20次移植,则需要两个施肥时间点,假设主机的胚胎接受的移植。因此,将需要四个注射菜(2 EXP条件× 2施肥时间点= 4)。长达一个星期,保存在4 ° C的板块。
  7. 生成第隔离板使用1%琼脂糖+ 0.7X MMR疫苗注射板与模具。请注射板加一个额外的每施肥时间点(4 +2施肥时间点= 6)相同数量的上限隔离。
  8. 注入500个单位绒毛膜促性腺激素显微注射前一天在一天中较晚的女性。商店女性在16-18 ° C过夜。

第二部分。 非洲爪蟾胚胎的RNA显微注射

A.制备用于显微注射

  1. 取出女性激素诱导它们放置在个人坦克包含1X产蛋解决方案(ELS)注 :我们不使用已在ELS两个多小时,卵子的质量,减少鸡蛋。因此, 在体外受精前约一个小时,我们放弃从油箱,使所有的鸡蛋只刚产下的蛋收集。
  2. 准备通过剪断尖获得直径为25-35微米的显微注射针。广场上picoinjector针和校准,使分配每次注射10 NL。
  3. 设置一个孵化至14 ° C。
  4. 一旦女性奠定了约一个小时,使用移液管从水箱取出鸡蛋和60毫米培养皿放入鸡蛋。鸡蛋尽可能多的ELS删除和替换1X的MMR。受精鸡蛋可以马上或在1X的MMR逗留长达一个小时。对于移植实验,这是最好的施肥两个菜,80%的鸡蛋最多的单层三个分批于上午11时左右,中午和下午1时。注射后,它们将被放置在14 ° C,使他们成长到第隔离(阶段8.5-9)和器官移植所需的阶段(第一阶段15;见我,#6段)部分。
  5. 要检查睾丸的质量,我们执行一个清晨施肥(上午8时),它允许我们提取从另一个男性的睾丸,如果从第一个精子是没有生命力的的。注:我们均质〜0.25睾丸在1 mL 1X孕产妇死亡率和增加约5至7%的卵母细胞板滴。
  6. 匀浆睾丸在体外授精的鸡蛋,一个小时后,使用果冻解决方案上的鸡蛋取出果冻大衣(164μl1M数码地面电视+ 10ml 1M三中,pH值8.8至50毫升蒸压nanopure水) 。等待,直到他们达到两细胞阶段开始排序,这需要约2小时18 ° C或1.5小时,在室温(22℃)。
  7. 使用一个TRANSF二吸管,排序均匀色素和均匀分裂的胚胎,作为显示在图3中左边的动物帽,到充满0.4X孕产妇死亡率+ 6%聚蔗糖注射菜很好。

B.微量注射

  1. 长达一个60毫米的培养皿盖顶部的封口膜。吸取2μL上的封口膜和使用PLI - 100来填补你的注射针吸你的第一个RNA样品。一定要检查样品针仍然是配药开始前注射液10 NL。
  2. 在另一盘7 500 PG YFP的RNA在一盘和您感兴趣的(如20 PG Noggin RNA)的基因加YFP的RNA注入20-30两细胞阶段的胚胎(两个卵裂球)。
  3. 广场100-200非注射胚胎,每个时间点,在另一个与聚蔗糖溶液注射菜。将它们和孵化器,同时注入的胚胎。这些都是要在第四部分中使用的主机。
  4. 注射后,所有胚胎孵育14℃过夜。重复所有的时间点。

第三部分。隔离注入胚胎的动物帽

  1. 清晨抵达阶段的胚胎。最早的时间点应该是第9期。删除那些没有生存。继续执行以下步骤,每个时间点分批工作。
  2. 从每盘倒掉的聚蔗糖的解决方案,并添加回0.7X MMR /庆大霉素解决方案。一个上限隔离菜,加0.7X MMR /庆大霉素解决方案的慷慨金额。使用移液管和地方在新鲜配制的第隔离菜一个,从他们的注射菜井打跑胚胎。
  3. 0.7X孕产妇死亡率+庆大霉素溶液中分离的动物帽,保持完整的分期2个或3个胚胎。无论是Gastromaster,安装有一个黄色的提示弯曲至400微米,或一双锐利5钳都可以使用。
  4. 直到第二天将在14 °彗星孵化器盖。孵化器在为上限的同时,保持在相同的供体组织的发育阶段,他们应该从主机胚胎。

第四部分。移植到侧翼上限

  1. 从第一个时间点从14℃培养箱取出瓶盖和胚胎阶段的胚胎。统一的黄色或红色荧光阳性的上限,根据示踪剂注入(图2),排序。
  2. 计数的上限数量,删除双阶段12-13胚胎与0.7X MMR /庆大霉素溶液新鲜配制的注射菜。随着尖锐的#5钳,删除每个卵黄膜。他们转移到该板块的上限,但要小心。如果没有他们的卵黄膜,胚胎可以快速解离水面。
  3. 使用gastromaster(黄尖,200 - 250微米的弯曲线,最高设置)或#5镊子,取出一个200微米见方一侧的胚胎阶段14日至15日(图3)。然后,削减了一半的上限(与gastromaster或#5镊子)和地方组织在主机中的胚胎中取得的孔。旋转以及对胚胎允许愈合。许多胚胎,你可以做,而他们在舞台15。重复所有的时间点。
  4. 胚胎通常会在30分钟内愈合。删除的死细胞(白)#5镊子轻柔的刷牙议案。养在18 ° C过夜。
  5. 荧光显微镜下解剖,荧光标记,移植组织的排序胚胎。把它们早在18 ° C至成长,直到42-43阶段。
  6. 在tricaine麻醉动物。在这一点上,你可以采取的荧光解剖显微镜下的图片。完成之后,修复,部分使用标记为您感兴趣的组织在原位杂交和免疫染色或执行。

图1
图1。有机玻璃设计铸造橡胶模具,用于胚胎控股菜。一个38 x 38毫米圆角方形(〜5毫米深)已经排到了一块50 × 50平方毫米和25毫米厚的有机玻璃。圆形,均匀分布的井直径(1.5毫米)已钻深1毫米到塑料。为了使弹性体的显微注射菜模具,倒入有机玻璃Sylgard弹性,使得它能够巩固,按制造商的说明。这弹性模是用来注射和第隔离板。

图2
图2。排序前移植的动物帽是重要的,因为表达可以有所不同 。动物在左边的第表示mCherry整个组织均匀,而右边的外植体参差不齐的表达,都将被丢弃。

图3
图3。主机tadpOLE开发了一个眼状结构,其侧翼从移植的动物第细胞。一种荧光图像已明的形象重叠。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

在这段视频中,我们已经证明我们的生物学家使用的经典技术,我们重新安排,以建立动物帽移植的实验版本。在室温条件下, 爪蟾胚胎发育非常迅速地通过9级和15级。通过放置在14℃,胚胎发育减慢,并可以在一个实验中进行更多的移植。如果有必要将增长到老年阶段(42/43)的胚胎,那么我们建议,利用转基因金星YFP的动物,因为年纪较大的蝌蚪注入荧光蛋白在信号衰。我们用这个实验,建立动物第组织表达EFTFs或Noggin被指定为形成眼状组织。此法可以用来作为一个简单的测试,以确定是否一个感兴趣的基因(S)确定一个特定的细胞的命运是必要的。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

这项工作得到了从研究经费,以防止失明(职业发展奖MEZ和ASV和不受限制授予眼科部),大肠杆菌明德Zeigler基金会(MEZ和ASV)和美国国家眼科研究所/美国国立卫生研究院(MEZ ,补助金R01EY015748和R01EY017964)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics