חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

Published 4/28/2007
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

השיטה הנוכחית מאפשרת cryostat לשחזור של חתך, קשה לניהול, חתיכות קטנות רקמות, כגון ביופסיה, פרוסות המוח. אנו מנצלים אלומיניום פשוט מקפיא הבמה כדי להקל על הטיפול רקמות cryostat רגיל שגרתי לייצר חלקים 5-10 מיקרון סדרתי של פרוסות 400 מיקרון עבה המוח.

Cite this Article

Copy Citation

Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חקירות רבות במדעי המוח, כמו גם מתחומים אחרים, לערב לימוד קטנות, אך חלקים מאקרוסקופיים או חלקים של רקמת שנשתמרו, הסיר טרי, או נכרת, אבל המשיכה קיימא, כמו פרוסת ההכנות של רקמת המוח. מחקרים מאוחרים יותר מיקרוסקופיים של חומר זה יכול להיות מאתגר, כמו דגימות רקמה עלול להיות קשה להתמודד. הפגינו כאן היא שיטה לקבלת סעיפים cryostat דקה של רקמה בעובי זה עשוי לנוע בין 0.2-5.0 מ"מ. אנו שגרתי לחתוך עבה 400 מיקרון Vibratome פרוסות המוח סדרתי לתוך סעיפים 5-10 מיקרון העטרה cryostat. פרוסות הם בדרך כלל בשימוש הראשון של הניסויים electrophysiology ואז דורשים ניתוח מיקרוסקופי של cytoarchitecture של האזור שממנו הקלטות נצפו. אנחנו צריכים לבנות מכשיר פשוט המאפשר הכנה מבוקרת לשחזור והמיקום של הפרוסה רקמות. מכשיר זה מורכב 5 ס"מ אורך גליל בקוטר של 1.2 ס"מ, המשמש כבמה הקפאת עבור הפרוסה. טבעת הדוקה שקופיות על קירות מתן גליל סביב פרוסה המאפשר את הרקמה להיות שקוע בתוך מתחם הקפאה (למשל, אוקטובר). זהו אז קפוא במהירות עם קרח יבש כתוש רקיק וכתוצאה מכך יכול להיות בעמדה בקלות חתך cryostat. סעיפים Thin ניתן להפשיר רכוב על גבי שקופיות מצופה לאפשר מחקרים נוספים שיש לבצע, כגון שיטות צביעה שונים, הכלאה באתרו, או אימונוהיסטוכימיה, כפי שהודגם כאן.

Protocol

  1. הכן עובש מהקלטת עבור פלטפורמת אוקטובר
  2. מלא עובש עם אוקטובר להקפיא בתוך cryostat או באמצעות קרח יבש כתוש.
  3. הסר את הסרט מרחבי פלטפורמה אוקטובר קפוא.
  4. יישר סימנים על צ'אק מקפיא בשלב cryostat גובר לנעול צ'אק.
  5. סעיף באמצעות פלטפורמת אוקטובר עד משטח שטוח.
  6. הסר resurfaced פלטפורמה אוקטובר מקום על הבמה הקפאת cryostat.
  7. דגימת רקמה פלייס (cryopreserved בעבר עם גליצרול 30% או סוכרוז ב PBS) ב אוקטובר
  8. הכן את העמודה הקפאה עם הטבעת החיצונית מקרין על 5 מ"מ מעל גבי טור להרכיב גם עבור אוקטובר
  9. בזהירות עמדה דגימת רקמה על פני השטח של מרכז עמודה מקפיא לאט להוסיף עד אוקטובר היטב מלא.
  10. הקף טור מקפיא עם קרח יבש כתוש. רקמות אוקטובר צריך להקפיא לחלוטין בתוך 20-60 שניות.
  11. עם העלייה בטמפרטורה הכנה, הטבעת החיצונית ניתן להסיר תוך המדגם נשאר קפוא.
  12. שקופיות מדגם הצידה טור מקפיא מקום cryostat.
  13. מניחים ירידה של אוקטובר על פני השטח של פלטפורמת אוקטובר ואת הדגימה עמדה (רקמה למטה) הפעלת לחץ תקיף. הדגימה במהרה להקפיא על גבי פלטפורמת אוקטובר
  14. צ'אק מאובטחת על cryostat הרכבה הבמה עם סימני מיושר.
  15. סעיף דרך אוקטובר שטחית כדי הדגימה רקמות.
  16. הפשירי הר חלקים דקים על גבי שקופיות זכוכית ולאחסן קפוא או בטמפרטורת החדר.
  17. Immunoreactions יכול להתבצע עבור רקמה רכוב על שקופיות הזכוכית.
  18. הוא מגיב ונקווה לשקופית, יכול להיות נסער בעדינות, עשויים להיות מכוסים אם רגישים לאור.
  19. בשלבים מאוחרים יותר של התגובה מבוצעים בקלות לתוך כלי קיבול אשפה על ידי היפוך שקופיות, הפתילה את השקופית, ולאחר מכן להחיל את מגיב הבאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מספק החוקרים עם תמציתי, קל לעקוב אחר קווי המתאר של כיצד להשיג חלקים cryostat דקה, קשה לניהול, חתיכות קטנות רקמות, כגון ביופסיה, פרוסות המוח למחקרים נוספים להתבצע, כגון מכתים שיטות שונות, הכלאה באתרו, או אימונוהיסטוכימיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats