Тонкие секционирования фрагмент Подготовка к Immunohistochemistry

Published 4/28/2007
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Настоящий метод позволяет воспроизводимых криостат секционирования маленький, трудно в управлении, тканевой части, такие как биопсия и мозг ломтиками. Мы используем простой этап замораживания алюминия для облегчения обработки ткани и стандартных криостате в плановом порядке выпускать 5-10 микрон серийных срезов от 400 микрон ломтики мозга.

Cite this Article

Copy Citation

Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Многие исследования в области неврологии, а также других дисциплин, связаны с изучением небольшой, но макроскопические части или участки тканей, которые сохранились, только что удален, или вырезали но сохранил жизнеспособным, как и в часть подготовки ткани головного мозга. Последующие микроскопические исследования этого материала может быть сложным, так как образцы тканей может быть трудно справиться. Продемонстрированный здесь метод получения тонких срезов тканей криостат с толщиной, которая может варьироваться от 0.2-5.0 мм. Мы регулярно вырезать 400 микрон ломтики мозга Vibratome серийно в 5-10 микрон корональные разделы криостата. Ломтиками, как правило, впервые использован для проведения экспериментов электрофизиологии, а затем требуют микроскопического анализа cytoarchitecture региона, из которого записи не наблюдалось. Мы построили простое устройство, которое позволяет контролировать и воспроизводимые подготовки и позиционирование ткани срез. Это устройство состоит из цилиндра 5 см в длину при диаметре 1,2 см, который служит замораживание почву для среза. Кольцо плотно скользит по цилиндр предоставления стены вокруг среза позволяет ткани, которая будет погружена в замораживании соединения (например, в октябре). Это потом быстро замороженные с дробленым сухой лед и в результате пластины можно легко позиции для криостата секционирования. Тонкие разделов могут быть оттепели монтажа на покрытие слайды, чтобы дальнейшие исследования должны быть выполнены, например, различные методы окрашивания, на месте гибридизация, или иммуногистохимии, как показано здесь.

Protocol

  1. Подготовка формы с магнитной ленты для платформы октября
  2. Заполните форму с октября Замораживание в криостате или с использованием дробленого сухого льда.
  3. Удалите ленту с замороженными вокруг платформы октября
  4. Совместите метки на замораживание патрон и криостат монтажа сцены и блокировки в патроне.
  5. Раздел по октябрь платформу, пока поверхность плоская.
  6. Удалить всплыли октября платформы и место на этапе замораживания криостата.
  7. Место образец ткани (ранее криоконсервированных с 30% глицерина или сахарозы в PBS) в октябре
  8. Подготовка замораживания колонки с внешним кольцом выступающие примерно на 5 мм выше верхней части рулевой колонки формирования хорошо октября
  9. Осторожно установите образец ткани на центр замерзания поверхности колонки и медленно добавить октября, пока хорошо не будет заполнен.
  10. Объемного замораживания колонку с дробленым сухим льдом. Ткани и октябре должна полностью заморозить в течение 20-60 секунд.
  11. В качестве подготовки повышение температуры, внешнее кольцо может быть удален в то время как образец остается замороженным.
  12. Слайд образца от замерзания в сторону колонны и место в криостате.
  13. Место капли октября на поверхности октября платформы и положение образца (ткань вниз) применения фирмы давление. Образцы быстро заморозить на платформу октября
  14. Безопасные патрон на криостате монтаж сцены с марками выровнены.
  15. Раздел по октябрь поверхностно ткани образца.
  16. Оттепель гору тонких срезов на предметные стекла и хранить замороженные или при комнатной температуре.
  17. Immunoreactions может быть выполнена для ткани установлены на стеклах.
  18. Реагент в пул на слайде, можно мягко взволнованным, и могут быть охвачены, если светочувствительные.
  19. Последующие этапы реакции легко осуществляется путем обращения в слайд отходов сосуда, влагу слайд, а затем нанесением следующего реагента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, представленные здесь предоставляет исследователям краткой, простой в последующей схема того, как для получения тонких срезов криостат мелких, трудно в управлении, тканевой части, такие как биопсия и мозг ломтиками для дальнейших исследований должны быть выполнены, например, различные методы окрашивания, на месте гибридизация, или иммуногистохимии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats