Dilim İmmünohistokimya için hazırlıklar İnce Kesit

Published 4/28/2007
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Mevcut yöntem, biyopsileri ve beyin dilimleri gibi küçük, zor yönetmek için, doku parçaları, kesit tekrarlanabilir Kriyostat sağlar. Biz basit bir alüminyum donma aşamasında doku taşıma ve rutin olarak 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri 5-10 mikron seri bölümleri üretmek için bir standart Kriyostat kolaylaştırmak için kullanır.

Cite this Article

Copy Citation

Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nörobilim yanı sıra diğer disiplinlerden birçok araştırmalar, küçük eğitim dahil, henüz korunmuş doku makroskopik parçalar veya bölümleri, taze beyin dokusu dilim hazırlıkları gibi, kaldırılır veya eksize ama canlı tutulur. Doku örnekleri ele almak zor olabilir, bu malzeme sonraki mikroskobik çalışmaları, zor olabilir. Burada gösterilen aralığı 0,2-5,0 mm kalınlığı ile ince bir doku Kriyostat bölümleri elde etmek için bir yöntemdir. Biz rutin olarak 5-10 mikron koronal Kriyostat bölüme seri 400 mikron kalınlığında Vibratome beyin dilimleri kesti. Dilimleri genellikle ilk elektrofizyoloji deneyleri için kullanılan ve daha sonra kayıtları gözlendi bölgenin hücre mimarisini mikroskopik analizi gerektirir. Biz kontrollü ve tekrarlanabilir hazırlanması ve doku dilim konumlama sağlayan basit bir aygıt inşa ettik. Bu cihaz, 1.2 cm çapında, donma dilim için bir aşama olarak görür uzun bir silindir 5 cm oluşur. Bir halka doku (örneğin, OCT) donma bileşik dalmış izin dilim etrafında silindir sağlayarak duvarları üzerinde rahatça kayar. Bu daha sonra ezilmiş kuru buz ile hızlı dondurulmuş ve ortaya çıkan gofret Kriyostat kesit için kolay pozisyon olabilir. İnce bölümler olabilir çözülme monte ileri çalışmalar, burada gösterildiği gibi, in situ hibridizasyon veya immünohistokimya gibi çeşitli boyama yöntemleri olarak gerçekleştirilebilir için izin kaplı Slaytlarınıza.

Protocol

  1. Ekim platformu için teypten kalıp hazırlayın.
  2. OCT ile kalıp doldurun. Kriyostat içinde veya ezilmiş kuru buz ile dondurun.
  3. Dondurulmuş Ekim platformu etrafında bandı çıkarın.
  4. Donma ayna ve Kriyostat montaj aşamasında Chuck kilitlemek ve işaretleri hizalayın.
  5. Yüzeyine kadar OCT platformu üzerinden Bölüm düzdür.
  6. Kriyostat dondurma sahnede yeniden su yüzüne çıktı Ekim platformu ve yer çıkarın.
  7. OCT Yeri doku örneği (daha önce PBS içinde% 30 gliserol veya sükroz ile Kriyoprezerve).
  8. Ekim için de oluşturan sütun üstünden yaklaşık 5 mm dış halka yansıtarak dondurma sütun hazırlayın.
  9. Dikkatle donma sütun yüzeyi merkezi üzerine pozisyon doku örneği ve iyi doludur kadar yavaşça Ekim eklemek.
  10. Ezilmiş kuru buz ile dondurma sütun Surround. Doku ve OCT 20-60 saniye içinde tamamen dondurmak gerekir.
  11. Örnek dondurulmuş kalırken, sıcaklık hazırlık arttıkça, dış bilezik çıkarılmalıdır.
  12. Dondurma sütun yanlara ve Kriyostat yer kapalı örnek kaydırın.
  13. Ekim platformu ve sabit basınç uygulayarak pozisyonda numune (doku aşağı) yüzey OCT Yeri bırakın. Numune Ekim platformu üzerine çabuk donar.
  14. Güvenli Chuck üzerine Kriyostat hizalanmış işaretleri ile birlikte sahne montaj.
  15. Ekim yoluyla doku örneği yüzeysel Bölümü.
  16. Cam slaytlar üzerine ince bölümler monte çözülme ve dondurulmuş ya da oda sıcaklığında saklamak.
  17. Immunoreactions cam slaytlar üzerine monte doku için yapılabilir.
  18. Reaktif, havuzlu slayt üzerine hafifçe ajite olabilir ve eğer ışığa duyarlı karşılanabilir.
  19. Reaksiyon daha sonraki aşamalarda kolayca slayt esneklik, atık yuvasına tersini slayt tarafından yapılan ve daha sonra bir sonraki reaktif uygulayarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan protokol ile araştırmacılar sağlayan bir özlü, kolay takip yapılacak ileri çalışmalar için biyopsileri ve beyin dilimleri gibi gibi küçük, zor yönetmek için, doku parçaları, ince Kriyostat bölümleri nasıl elde etmek için ana hatları in situ hibridizasyon veya immünohistokimya çeşitli boyama yöntemleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats