Seccionamento fina de Preparações Slice para Imunohistoquímica

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

O presente método permite criostato reprodutíveis corte de pequenas peças, difíceis de gerenciar, de tecidos, tais como biópsias e fatias de cérebro. Nós utilizamos um estágio de congelamento simples de alumínio para facilitar a manipulação de tecido e um criostato padrão para produzir seções rotineiramente micron 10/05 de série a partir de 400 micron fatias de cérebro de espessura.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

Muitas investigações em neurociência, assim como outras disciplinas, envolvem o estudo pequeno, ainda peças macroscópicas ou secções do tecido que foram preservados, recém-retirado, ou cortado, mas manteve viável, como em preparações fatia de tecido cerebral. Subseqüentes estudos microscópicos deste material pode ser um desafio, como as amostras de tecido pode ser difícil de manusear. Demonstrado aqui é um método para a obtenção de seções criostato fina de tecido com uma espessura que pode variar 0,2-5,0 mm. Rotineiramente cortar 400 micron fatias de cérebro de espessura Vibratome série em 50-10 micron seções criostato coronal. As fatias são normalmente utilizados pela primeira vez para experimentos de eletrofisiologia e, em seguida, exigem uma análise microscópica da citoarquitetura da região a partir do qual as gravações foram observados. Construímos um dispositivo simples que permite a preparação controlada e reprodutível e posicionamento da fatia de tecido. Este dispositivo consiste de um cilindro de 5 cm de comprimento com um diâmetro de 1,2 cm, que serve como um estágio de congelamento da fatia. Um anel confortavelmente desliza sobre as paredes do cilindro em torno do fornecimento de fatia permitindo que o tecido a ser imerso em composto de congelamento (por exemplo, OCT). Este é, então, rapidamente congelados em gelo seco esmagado eo wafer resultante pode ser facilmente para a posição de corte do criostato. Seções finas podem ser descongelar montado em lâminas revestidas para permitir que novos estudos a serem realizados, como vários métodos de coloração, hibridização in situ, ou imuno-histoquímica, como demonstrado aqui.

Protocol

  1. Prepare o molde da fita para a plataforma de outubro
  2. Preencha o molde com outubro Congelar dentro criostato ou usando gelo seco esmagado.
  3. Retire a fita em torno da plataforma outubro congelados.
  4. Alinhe as marcas de congelamento e chuck estágio criostato de montagem e fechamento de mandril.
  5. Secção da plataforma de outubro até a superfície é plana.
  6. Remover ressurgiu plataforma de outubro e coloque em criostato estágio de congelamento.
  7. Colocar a amostra de tecido (previamente criopreservados com glicerol 30% ou sacarose em PBS), em outubro
  8. Preparar a coluna de congelamento com anel externo projetando cerca de 5 mm acima do topo da coluna formando bem para outubro
  9. Atentamente a posição amostra de tecido para centro da superfície da coluna de congelamento e adicionar lentamente outubro até bem está cheia.
  10. Surround coluna congelando com gelo seco esmagado. Tecido e outubro deve congelar completamente dentro de 20-60 segundos.
  11. Com o aumento da preparação de temperatura, o anel externo podem ser removidos enquanto a amostra permanece congelado.
  12. Deslizar para os lados da amostra off coluna congelamento e coloque em criostato.
  13. Local de queda de outubro na superfície de outubro plataforma e espécime posição (tecido para baixo) aplicar uma pressão firme. Espécime vai congelar rapidamente na plataforma outubro
  14. Chuck seguro em criostato de montagem palco com marcas alinhadas.
  15. Secção através outubro superficial para a amostra de tecido.
  16. Descongelar montar seções finas em lâminas de vidro e armazenar congelados ou à temperatura ambiente.
  17. Immunoreactions pode ser realizada para o tecido montados em lâminas de vidro.
  18. Reagente é agrupada em slide, pode ser suavemente agitado, e pode ser coberto se sensível à luz.
  19. Fases posteriores da reação são facilmente realizados por deslize invertendo em recipiente de resíduos, wicking o slide, e então aplicar o reagente seguinte.

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Discussion

O protocolo apresentado aqui fornece aos pesquisadores uma concisa, fácil de seguir esboço de como obter seções criostato fina de pequenas peças, difíceis de gerenciar, de tecidos, tais como biópsias e fatias de cérebro de novos estudos a serem realizados, tais como vários métodos de coloração, hibridização in situ, ou imuno-histoquímica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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