Sectionnement des préparations minces tranches d'immunohistochimie

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

Le présent procédé permet cryostat reproductibles sectionnement de petits morceaux de tissu, difficile à gérer, comme les biopsies et les tranches de cerveau. Nous utilisons une étape de congélation en aluminium simple pour faciliter la manipulation des tissus et un cryostat standard pour produire en routine des sections 50 à 10 microns de série à partir de 400 microns tranches épaisses du cerveau.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

De nombreuses enquêtes en neurosciences, ainsi que d'autres disciplines, visent à étudier les petits, mais des morceaux macroscopiques ou des morceaux de tissu qui ont été préservés, fraîchement prélevées, ou excisée mais a gardé viables, comme dans les préparations tranche de tissu cérébral. Après des études au microscope de ce matériau peut être difficile, car les échantillons de tissus peuvent être difficiles à manipuler. Démontrée ici est une méthode pour obtenir des coupes de tissu mince avec une épaisseur qui peut aller de 0,2 à 5.0 mm. Nous avons régulièrement coupé 400 microns d'épaisseur des tranches de cerveau Vibratome série en sections 50-10 microns cryostat coronale. Les tranches sont généralement d'abord utilisé pour des expériences d'électrophysiologie et nécessitent une analyse microscopique de la cytoarchitecture de la région à partir de laquelle les enregistrements ont été observées. Nous avons construit un dispositif simple qui permet de préparer contrôlées et reproductibles et le positionnement de la tranche de tissu. Ce dispositif est constitué d'un cylindre 5 cm de longueur avec un diamètre de 1,2 cm, qui sert comme une étape de congélation pour la tranche. Un anneau glisse parfaitement sur les parois du cylindre fournissant environ la tranche permettant au tissu d'être immergé dans le composé de congélation (par exemple, OCT). Il est ensuite rapidement congelé à la glace sèche écrasée et la plaquette en résulte peut être facilement de position pour la coupe cryostat. Les lames minces peuvent être montés sur des dégel des lames recouvertes de permettre à d'autres études à réaliser, telles que des méthodes de coloration différents, l'hybridation in situ, ou l'immunohistochimie, comme démontré ici.

Protocol

  1. Préparer la moisissure à partir de bandes pour la plateforme octobre
  2. Remplir le moule avec octobre Gel dans les cryostat ou en utilisant la glace pilée et sec.
  3. Retirer le ruban à travers octobre plate-forme gelée.
  4. Aligner des marques sur le gel et le stade de Chuck cryostat de montage et de verrouillage dans le mandrin.
  5. Coupe à travers la plate-forme octobre jusqu'en surface est plane.
  6. Retirer refait surface plate PTOM et lieu sur la scène de congélation cryostat.
  7. Échantillon de tissu Lieu (préalablement cryoconservées avec le glycérol 30% ou de saccharose dans du PBS) en octobre
  8. Préparer colonne de gel avec bague extérieure projetant d'environ 5 mm au-dessus haut de la colonne formant ainsi des octobre
  9. Soigneusement position de l'échantillon de tissu sur le centre de la surface de la colonne de congélation et ajoutez lentement jusqu'en octobre est bien rempli.
  10. Surround colonne de gel de la glace sèche écrasée. Tissus et les PTOM devraient geler complètement dans les 20-60 secondes.
  11. Comme l'augmentation de la température de la préparation, l'anneau extérieur peut être retiré tandis que l'échantillon reste gelé.
  12. Faites glisser l'échantillon hors gel et le côté colonne de place dans un cryostat.
  13. Baisse de la Place de l'OCT à la surface de la plateforme OCT et spécimen de la position (tissu vers le bas) appliquant une pression ferme. Spécimen congeler rapidement sur la plateforme octobre
  14. Fixez mandrin sur cryostat de montage scène avec des marques alignées.
  15. Section travers octobre superficielle à l'échantillon de tissu.
  16. Dégel montage des lames minces sur des lames de verre et de conserver congelés ou à température ambiante.
  17. Immunoréactions peut être effectuée pour les tissus montés sur lames de verre.
  18. Le réactif est mis en commun sur la glissière, peut être doucement agité, et peut être couvert si sensible à la lumière.
  19. Les étapes ultérieures de la réaction sont facilement réalisées par glisser inversion dans le réceptacle des déchets, évacuant la diapositive, puis en appliquant le réactif suivant.

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Discussion

Le protocole présenté ici fournit aux chercheurs une présentation concise, facile à suivre aperçu de la façon d'obtenir des coupes cryostat mince de petits morceaux de tissu, difficile à gérer, comme les biopsies et les tranches de cerveau pour poursuivre des études à réaliser, tels que différentes méthodes de coloration, l'hybridation in situ, ou immunohistochimie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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