Sezionamento sottile fetta di preparativi per immunoistochimica

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

Il metodo attuale consente criostato riproducibile sezionamento di piccole dimensioni, difficili da gestire, pezzi di tessuto, come ad esempio biopsie e fette di cervello. Utilizziamo una semplice fase di congelamento in alluminio da facilitare la manipolazione di tessuti e un criostato standard per produrre regolarmente sezioni 5-10 micron di serie da 400 sezioni di cervello micron di spessore.

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Park, J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194, doi:10.3791/194 (2007).

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Abstract

Molte indagini nel campo delle neuroscienze, così come altre discipline, coinvolgono lo studio piccolo, ma pezzi macroscopici o sezioni di tessuto che sono stati conservati, appena rimossa, o espunto ma mantenuto vitale, come in preparazioni fetta del tessuto cerebrale. Successivi studi microscopici di questo materiale può essere impegnativo, come i campioni di tessuto può essere difficile da gestire. Dimostrato qui è un metodo per ottenere sezioni congelate di tessuto sottile con uno spessore che può variare 0,2-5,0 mm. Siamo regolarmente tagliato 400 micron di spessore fette di cervello Vibratome serialmente in 5-10 sezioni congelate micron coronale. Le fette sono tipicamente utilizzato per un primo esperimento di elettrofisiologia e quindi richiedere l'analisi microscopica dei citoarchitettura della regione da cui sono state osservate le registrazioni. Abbiamo costruito un semplice dispositivo che permette la preparazione controllato e riproducibile e il posizionamento della fetta del tessuto. Questo dispositivo è costituito da un cilindro di 5 cm di lunghezza con un diametro di 1,2 cm, che funge da palcoscenico congelamento della porzione. Un anello scivola perfettamente sulle pareti del cilindro che fornisce in tutto il fetta permettendo al tessuto di essere immersi in mescola congelamento (ad esempio, OCT). Questa è poi rapidamente congelato con ghiaccio tritato secco e il wafer risultante può essere posizione facilmente per sezionamento criostato. Sezioni sottili possono essere disgelo-montate su vetrini rivestiti per permettere ulteriori studi per essere eseguito, come vari metodi di colorazione, di ibridazione in situ, o immunoistochimica, come illustrato di seguito.

Protocol

  1. Preparare stampo da nastro per la piattaforma ottobre
  2. Riempire stampo con ottobre Blocco entro criostato o utilizzando schiacciato ghiaccio secco.
  3. Rimuovere il nastro di tutto congelato piattaforma ottobre
  4. Allineare segni sul mandrino congelamento e criostato fase di montaggio e serratura a mandrino.
  5. Sezione attraverso la piattaforma di ottobre fino a superficie piana.
  6. Rimuovere riemersi piattaforma ottobre e il luogo sul palco congelamento criostato.
  7. Luogo campione di tessuto (precedentemente crioconservati con il 30% glicerolo o saccarosio in PBS) a ottobre
  8. Preparare colonna congelamento con anello esterno proiettando circa 5 mm sopra la parte superiore della colonna formando bene per ottobre
  9. Posizionare accuratamente campione di tessuto nella parte centrale della superficie colonna congelamento e aggiungere lentamente fino a ottobre e si riempie.
  10. Surround colonna congelamento schiacciato con ghiaccio secco. Tessuti e ottobre dovrebbero completamente blocco entro 20-60 secondi.
  11. Con l'aumentare della preparazione della temperatura, l'anello esterno può essere rimosso mentre il campione rimane congelato.
  12. Diapositiva campione fuori lateralmente colonna congelamento e il luogo in criostato.
  13. Goccia luogo di ottobre sulla superficie della piattaforma di ottobre e il campione di posizione (il tessuto verso il basso) applicando una pressione decisa. Campione rapidamente congelare sulla piattaforma ottobre
  14. Mandrino sicuro sul criostato di montaggio palco con segni allineati.
  15. Sezione di ottobre superficiale al campione di tessuto.
  16. Scongelare il montaggio su sezioni sottili lastre di vetro e conservare congelati oa temperatura ambiente.
  17. Immunoreazioni può essere eseguita per tessuto montate su lastre di vetro.
  18. Il reagente è in pool sul vetrino, possono essere leggermente agitato, e possono essere coperti se sensibile alla luce.
  19. Le successive fasi della reazione sono facilmente eseguiti da scivolare invertendo nella presa dei rifiuti, che l'assorbimento della diapositiva e quindi applicando il reagente successivo.

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Discussion

Il protocollo qui presentato fornisce ai ricercatori un conciso, facile da seguire di ingombro di come ottenere criostato sezioni sottili di piccole dimensioni, difficili da gestire, pezzi di tessuto, come ad esempio biopsie e fette di cervello per ulteriori studi da eseguire, come ad esempio vari metodi di colorazione, di ibridazione in situ, o immunoistochimica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
O. C. T. Ted Pella, Inc. 27050
Glycerol Solution 30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution 30% Sucrose Solution in PBS w/v

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References

  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Comments

3 Comments

  1. Thank-you for posting this video. Your device seems to work well with small tissue, but what do you use for freezing whole adult rat brains? Is the powdered dry ice method sufficient alone to reduce freezing artifact if you are freezing a whole adult brain? Do you have an alternative procedure for these applications?   Much appreciated,
    Neil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 23, 2008 - 4:04 AM
  2. Hi Neil, you actually can get a pretty good freeze with finely powdered dry ice. Just cover and let freeze for 3-5 minutes.  I would recommend, however, immersing the whole brain in isopentane that has been chilled (~30 minutes) in dry ice.  Just leave the brain in isopentane for 30 seconds, otherwise it can distort and fracture.  You will then need to let the (very cold, -80 degrees) brain equilibrate (warm up) to your cryostat or microtome temperature in order for it to cut smoothly.
    Good luck!
    Miles

    Miles G. Cunningham, MD PhD
    Director, Laboratory for Neural Reconstruction
    Administrative Director, McLean Fellowship in
    Neuropsychiatry and Behavioral Neurology
    Chair, ANPA Programs Committee
    Executive Director, Asniya, Inc.
    MRC 333, McLean Hospital
    Harvard Medical School
    115 Mill Street
    Belmont, MA  0²478
    office:     617.855.²051
    fax:         617.855.3199
    page:      617.855.²000

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2008 - 5:18 PM
  3. Thanks for this very helpful video. I'm interested in knowing where you purchased the freezing rod and ring that is used to form the sample mold. Alternatively what metal is the rod made of and is there any significance to the length of the freezing rod used?

    Reply
    Posted by: Ellen Y.
    April 23, 2010 - 3:57 PM

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