टी लहर आयन गतिशीलता मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन परिसर विश्लेषण के लिए मूल प्रायोगिक प्रक्रिया

Biology
 

Summary

आयन स्पेक्ट्रोमेट्री गतिशीलता जन एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी है कि गैस चरण आयनों अलग है उनकी टक्कर पार अनुभाग और जन के आधार पर. विधि समग्र आकार और प्रोटीन परिसरों टोपोलॉजी पर तीन आयामी जानकारी प्रदान करता है. यहाँ, हम साधन स्थापित करने और अनुकूलन, बहाव बार के अंशांकन, और डेटा की व्याख्या के लिए एक बुनियादी प्रक्रिया रूपरेखा.

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Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis. J. Vis. Exp. (41), e1985, doi:10.3791/1985 (2010).

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Abstract

Protocol

प्रक्रिया का वर्णन हम IM एमएस प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण पर पूरी तरह ध्यान केंद्रित. इसलिए, हम सुझाव है कि संरचनात्मक एमएस के क्षेत्र के साथ अपरिचित शोधकर्ताओं नमूना तैयार कदम, साधन अंशांकन और एमएस और अग्रानुक्रम एमएस अनुकूलन Kirshenbaum एट अल में वर्णित प्रक्रियाओं के लिए उल्लेख 2009 http://www.jove.com/index/details . stp आईडी? 1954 = सामान्य में, इस प्रोटोकॉल परिसर के कम micromolar अमोनियम एसीटेट (एम 1, 6-8 पीएच 0.005) के रूप में एक अस्थिर बफर में (1-20 सुक्ष्ममापी) सांद्रता शामिल है. यह देखते हुए कि 1-2 μl केशिका nanoflow प्रति खपत होती है, हम एक न्यूनतम मात्रा के रूप में 10-20 μl सुझाव है, एमएस शर्तों के अनुकूलन को सक्षम करने के लिए.

भाग 1: एक आयन स्पेक्ट्रोमेट्री गतिशीलता जन स्पेक्ट्रम हासिल करना

  1. मास स्पेक्ट्रोमीटर: गतिशीलता-TOF, सकारात्मक आयन अधिग्रहण, और वी - मोड ऑपरेशन के निम्नलिखित मोड पर सेट करें.
  2. सभी गैसों पर मुड़ें (एपीआई जाल, और आईएमएस). हम ट्रैप / स्थानांतरण के लिए आईएम जुदाई के लिए 2, N, और एर का उपयोग करें . अनुशंसित प्रारंभिक मान 1.5 मिलीग्राम / ट्रैप क्षेत्र के लिए मिनट और 24 मिलीग्राम / आईएमएस डिवाइस के लिए मिनट के एक गैस प्रवाह हैं.
  3. अधिग्रहण मी / z रेंज सेट. एक अज्ञात प्रोटीन परिसर के लिए, हम एक व्यापक जन रेंज है, जो तब इच्छित मानों को कम किया जा सकता है की प्रारंभिक उपयोग का सुझाव देते हैं. समानांतर में, अधिकतम संचरण दक्षता के लिए एमएस प्रोफ़ाइल समायोजित करें. बड़े परिसरों के लिए, अधिग्रहण जन रेंज 1,000 से सेट किया जाना चाहिए - 32,000 मीटर z /, और एमएस ऑटो के लिए प्रोफ़ाइल. अन्यथा, प्रोफ़ाइल निम्नलिखित चार्ट के अनुसार हो सकता है, सेट कर सकते हैं:
    मी / Z ध्यान केन्द्रित करना (%) रैंप (%)
    960 10 20
    3200 30 40
    10667
  4. आरएफ सेटिंग की जाँच करें और यदि आवश्यक हो, इस प्रकार, बड़े प्रोटीन परिसरों के लिए उपयुक्त मान को समायोजित:
    स्रोत जाल आईएमएस स्थानांतरण
    आरएफ ऑफसेट 450 380 380 380
    आरएफ लाभ 0 0 0 0
    आरएफ सीमा 450 380 380 380
  5. केशिका (1,050-1,400 वी) वोल्टेज और कम nanoflow दबाव (0.00-0.03 बार) लागू करें. एक बार स्प्रे शुरू की है, के लिए एक न्यूनतम मूल्य के लिए nanoflow दबाव को कम करने की कोशिश. इसके अलावा, शंकु के लिए सम्मान के साथ केशिका की स्थिति को समायोजित करें.
  6. एमएस अधिग्रहण पैरामीटर समायोजित, के लिए एक अच्छी तरह से हल एमएस स्पेक्ट्रम हासिल साधन साथ दबाव ढाल, और नमूने शंकु के रूप में अच्छी तरह के रूप में निष्कर्षण शंकु, पूर्वाग्रह जाल, और संभावित सेटिंग्स स्थानांतरण, सभी (संबद्ध में विस्तृत अनुकूलित किया जाना चाहिए जौव प्रोटोकॉल Kirshenbaum एट अल 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954). हालांकि इन मानकों नमूना निर्भर हैं, स्थितियों हम विभिन्न आयन जनता के एमएस स्पेक्ट्रा प्रोटीन परिसरों के लिए पेप्टाइड से प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया, तालिका 1 में रेखांकित कर रहे हैं, (यह भी देखें एक चित्र). जटिल करने की कोशिश की सक्रियता कम से कम धीरे धीरे (~ 10 वी के चरणों में) चोटी की स्थिति को बदलने के बिना नमूना शंकु जाल, और पूर्वाग्रह voltages कम.
  7. एक बार एक इष्टतम जन स्पेक्ट्रम प्राप्त होता है बहाव समय प्रोफ़ाइल समायोजित किया जाना चाहिए. जब प्रोटीन असेंबलियों, दोनों बड़े पैमाने पर और गतिशीलता माप के लिए इष्टतम स्थितियों का विश्लेषण अक्सर असंगत हैं, इसलिए, यह महत्वपूर्ण है दोनों के बीच उचित संतुलन. कुल मिलाकर, आयन गतिशीलता साजिश जैसे अनुकूलित किया जाना चाहिए कि चोटियों पूरे बहाव समय सीमा पर वितरित कर रहे हैं, और पीक प्रोफ़ाइल चिकनी है, एक गाऊसी वितरण (छवि 2A, 2B) आ. महत्वपूर्ण एकाधिक रचना के गरीब जुदाई से संबंधित हो सकता है चोटी की विषमता है.
  8. एक सामान्य नियम के रूप में, तीन पैरामीटर, टी तरंग वेग, टी लहर ऊंचाई और आईएमएस गैस प्रवाह दर गतिशीलता जुदाई का अनुकूलन करने के लिए tuned किया जा सकता है. टी लहर वेग बढ़ाने बहाव समय वितरण प्रोफ़ाइल को चौड़ा है, जबकि वृद्धि हुई टी लहर ऊँचाई मान संकीर्ण जाएगा. इसी तरह, आईएमएस गैस का प्रवाह बढ़ाने उच्च मूल्यों (न्यूनतम आईएमएस गैस 10 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह होना चाहिए) की ओर बहाव समय प्रोफ़ाइल बदलाव होगा. हम दो तीन उपलब्ध चर तय की जा रही, और तीसरे अनुकूलन तक आईएम स्पेक्ट्रम अच्छी तरह हल (छवि 2B) का सुझाव देते हैं. यह अंत करने के लिए, 250 m / s और 24 मिलीग्राम / मिनट, फिर टी लहर वेग और गैस प्रवाह निर्धारितspectively. फिर, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, 3 वी टी लहर ऊंचाई सेट और एक stepwise तरीके में, यह एक वी वेतन वृद्धि में वृद्धि. सामान्य में, बड़े आयनों उच्च लहर ऊंचाइयों की आवश्यकता होगी. आमतौर पर, वहाँ कोई आईएमएस दबाव को संशोधित करने की आवश्यकता है, तथापि, जब उच्च पूर्वाग्रह voltages ट्यूनिंग के लिए आवश्यक हैं, आईएमएस गैस को कम करने के पूर्वाग्रह वोल्टेज मूल्य में कमी और इसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन जटिल सक्रियण में कमी सक्षम हो जाएगा. कुल मिलाकर, 10-12 टी / Δt के अधिक से अधिक संकल्प पहुँच सकता है.
  9. जब शर्तों (कम ऊंचाई टी लहर या उच्च वेग टी लहर और / या उच्च आईएम दबाव) अनुकूलित नहीं कर रहे हैं, आयनों IM डिवाइस के माध्यम से प्रभावी ढंग से नहीं पार, और अपनी यात्रा अब अगले आयन के लिए आवश्यक समय की तुलना में लग सकता है पैकेट गतिशीलता सेल में जारी किया जाएगा. एक परिणाम के रूप में, एक नया आयन पैकेट ट्रैप क्षेत्र से जारी किया पहले पिछले पैकेट ढकेलनेवाला क्षेत्र के लिए दिया गया. यह एक 'रोल से अधिक प्रभाव के लिए नेतृत्व में बहाव समय स्पेक्ट्रम के पहले भाग में मनाया चोटी पीछा बढ़त (छवि 2C) में आयनों के समान है. इस artifact के टी - लहर ऊंचाई बढ़ रही है, और टी तरंग वेग और आईएमएस दबाव कम करने के द्वारा समाप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, जाल रिलीज के समय समायोजित किया जा सकता है. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए मान्य है कि स्थानांतरण टी लहर ऊंचाई कम से कम वी. 5 सेट है आईएमएस सेल की ओर आयनों के रिसाव को रोकने के, हम अनुशंसा करते हैं कि गतिशीलता जाल ऊंचाई अधिकतम स्तर (30 वी) में रखा जाना.
  10. कम वेग और स्थानांतरण टी - तरंगों की उच्च आयाम बहाव समय वितरण प्रोफ़ाइल (छवि 2 डी) के rippling "करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जब यह artifact के आयनों (आयन समय / आगमन बहाव) की गतिशीलता जुदाई स्थानांतरण और TOF क्षेत्रों के माध्यम से बनाए रखा नहीं है होता है, ढकेलनेवाला आवृत्ति और हस्तांतरण वेग टी लहर के बीच आंशिक तुल्यकालन के कारण. आदेश में इस प्रभाव को खत्म करने के लिए, या तो ढकेलनेवाला समय या स्थानांतरण वेग टी लहर समायोजित किया जाना चाहिए. चूंकि ढकेलनेवाला आवृत्ति जन रेंज से संबंधित है, इस artifact के जब इस पैरामीटर बदल जाता है फिर से प्रकट हो सकता है. टी लहर ऊंचाई एक मामूली प्रभाव डालती है, हालांकि इसकी कमी भी लहर को खत्म करने में मदद कर सकते हैं.
  11. एक बार aforementioned मापदंडों अनुकूलित कर रहे हैं, IM-एमएस डेटा प्राप्त किया जा सकता है.

भाग 2: प्रयोगात्मक शर्तों के स्क्रीनिंग के लिए देशी संरचनाओं की गतिशीलता माप सुनिश्चित

अत्यधिक हल एमएस चोटियों को प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन परिसरों अक्सर मास स्पेक्ट्रोमीटर के भीतर सक्रिय हैं, अवशिष्ट पानी और बफर 11 घटकों के विपठ्ठन को बढ़ावा देने के. हालांकि, अगर सक्रियकरण ऊर्जा एक दहलीज मूल्य से परे वृद्धि हुई है, आंशिक रूप से खुलासा कई मध्यवर्ती 12 राज्यों, जो देशी, समाधान राज्य संरचना (छवि 3A - सी) के अनुरूप उम्मीद नहीं कर रहे हैं बनाने प्रेरित किया जा सकता है. एक परिणाम के रूप में, बहाव समय चोटी और स्थानांतरित किया जा सकता है चौड़ी, संरचनाओं सामने आया विषम आबादी को दर्शाती है.
आदेश में बहाव समय समाधान चरण संरचनाओं के साथ संगत डेटा प्राप्त करने के लिए, यह आवश्यक है ध्यान से आयनों के लिए प्रयोग किया जाता तेजी आईएम जुदाई से पहले voltages नियंत्रण. इसके अलावा, उच्च एमएस संकल्प के लिए यह जाल वोल्टेज के बजाय हस्तांतरण में वृद्धि करने के लिए बेहतर है. आईएम डिवाइस के रूप में तैनात है, पहले, स्थानांतरण क्षेत्र और TOF विश्लेषक द्वारा पीछा किया, इसलिए, सक्रियण आईएम माप के बाद आयनों और अप्रभावित रहता है, जबकि एमएस सटीकता बढ़ा जा सकता है है.

मान्य डाटा अधिग्रहण स्थिति है कि परिसर के देशी संरचना को बनाए रखने के तहत किया जाता है है, यह सिफारिश की है कि डेटा प्रयोगात्मक और समाधान की स्थिति की एक सीमा है, बजाय पर एक एकल पैरामीटर का सेट अनुकूलित के अनुसार दर्ज किया:

  1. एक stepwise तरीके में केशिका और शंकु voltages बढ़ाएँ, जबकि बहाव समय स्पेक्ट्रम पर प्रभाव की निगरानी.
  2. चरण 1 में, एक stepwise तरीके से जाल टक्कर वोल्टेज में वृद्धि, और 10 वी अंतराल पर डेटा प्राप्त.
  3. सामने आया रचना की पहचान और अधिग्रहीत डेटा का आकलन करने के लिए, मैन्युअल रूप से एसिटिक एसिड के साथ 2-7 की एक pH सीमा पर नमूना titrating प्रोटीन परिसर के पृथक्करण प्रेरित, और डेटा (3B छवि) रिकॉर्ड.

भाग 3: बहाव समय मूल्यों और पार के अनुभागीय क्षेत्रों के बीच correlating

पारंपरिक आईएम माप, जो में मापा बहाव समय मानों रैखिक Ω करने के लिए संबंधित हैं के विपरीत, टी लहर आईएमएस सिस्टम में, क्रॉस अनुभागीय क्षेत्र एक अंशांकन दृष्टिकोण से परिभाषित किया गया है. इस प्रकार, बजाय एक निरपेक्ष माप, एक रिश्तेदार घातीय सहसंबंध मापा बहाव बार और Ω 1,13 के बीच उत्पन्न होता है: एक समीकरण

जहां टी डी मापा बहाव समय है, और एक्स अनुपात निरंतर है कि एक अंशांकन वक्र से निकाला जा सकता है . अंशांकन प्रदर्शन हैज्ञात Ω (पारंपरिक IM प्रयोगों से मापा) के साथ आयनों के बहाव के समय को मापने के द्वारा एड.

  1. बहाव समय मापन विकृत प्रोटीन घोड़ा साइटोक्रोम सी, घोड़े दिल मायोग्लोबिन और गोजातीय जाना जाता टक्कर पार वर्गों के साथ ubiquitin का उपयोग कैलिब्रेटेड हैं. यह अंत करने के लिए, 49/49/2 में 10 सुक्ष्ममापी, मात्रा अनुपात के समाधान, पानी / मेथनॉल / एसिटिक एसिड (इस्तेमाल किया अभिकर्मकों तालिका 3 में उल्लिखित हैं) तैयार किया जाना चाहिए.
  2. बिल्कुल एक ही साधन लक्ष्य प्रोटीन या प्रोटीन जटिल के लिए इस्तेमाल शर्तों के तहत calibrant प्रोटीन के लिए IM-एमएस डेटा मोल: 7 समीकरण (भाग 1). सभी voltages और दबाव मूल्यों के समान हो सकता है, आईएम जुदाई सेटिंग्स के संरक्षण चाहिए.
  3. Calibrant प्रोटीन के प्रत्येक आरोप राज्य के लिए प्रयोगात्मक बहाव समय (टी डी) मूल्य (भाग 4 में वर्णित) निकाल सकते हैं.
  4. Calibrant बहाव बार के प्रत्येक (टी डी) (तालिका 2) निम्न समीकरण का उपयोग कर सही: 2 समीकरण , जहां मी / z मनाया आयन के बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी अनुपात है, और ग बढ़ी ड्यूटी चक्र (EDC) देरी एक गुणांक है. 1.4 और 1.6 के बीच आम तौर पर इसका मूल्य, साधन पर निर्भर है. अधिग्रहण सेटिंग्स | | अधिग्रहण सेटअप टैब EDC के मूल्य प्रणाली के भीतर संकेत दिया है.
  5. प्रो डेविड Clemmer धन्यवाद क्रॉस धारा का प्रयोग:
    http://www.indiana.edu/ clemmer ~ / / अनुसंधान पार% 20section% 20database/Proteins/protein_cs.htm दोनों आयन प्रभारी राज्य और कम द्रव्यमान के लिए 14 calibrant पार अनुभाग के प्रत्येक सही . 3 समीकरण
    जहां Ω सी पार अनुभाग सही, Ω साहित्य पार अनुभाग, Z आयन प्रभारी राज्य है, मीटर calibrant आयन के आणविक भार है, और एम जी आईएम पृष्ठभूमि गैस की आणविक वजन (आमतौर पर है 2 एन).
  6. (टी डी) में के खिलाफ प्लॉट (Ω सी) (4A छवि).
  7. जिसके परिणामस्वरूप वक्र निम्न समीकरण से मेल खाती है है: 4 समीकरण मापदंडों एक्स और एक एक रैखिक संबंध के लिए साजिश फिटिंग द्वारा निकाला जा सकता है . ढलान एक्स घातीय अनुपात कारक करने के लिए मेल खाती है और फिट निर्धारित स्थिरांक का प्रतिनिधित्व करता है.
  8. फिट सहसंबंध गुणांक r 2, Pearson 's समीकरण का उपयोग कर की गणना: 5 समीकरण . R 2 के लिए स्वीकार्य मूल्यों 0.95 (4B छवि) से अधिक हैं. एक कम सहसंबंध गुणांक मूल्य के कारण हो सकता है:
    1. अधूरा प्रोटीन calibrants का खुलासा. यह मध्यवर्ती राज्यों की विषम विधानसभा की वजह से चौड़ा शिखर नेतृत्व करेंगे.
    2. हमारे अनुभव में, एक वृद्ध नमूना आईएम स्पेक्ट्रा खराब कर सकते हैं.
    3. असदृश प्रयोगात्मक शर्तों विभिन्न calibrant प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया. इस मामले में, प्रत्येक प्रोटीन के लिए डेटा की साजिश रचने अलग विविध सहसंबंध गुणांक उत्पन्न, हालांकि उनमें से प्रत्येक के 0.95 की तुलना में अधिक होना चाहिए चाहिए.
    4. शोर डेटा और गलत चौरसाई और बहाव समय वितरण की केंद्रित.
    5. गणना त्रुटि.
  9. Calibrant बहाव का उपयोग कर समय निर्धारित घातीय कारक, एक्स, चरण 7 में प्राप्त Recorrect: 8 समीकरण
  10. एक मान्यता कदम के रूप में, replot Ω सी बनाम 10 समीकरण और सहसंबंध गुणांक को परिभाषित. 0.95 की तुलना में उच्च मूल्यों के लिए उम्मीद की जा रहे हैं.
  11. चरण 4 में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार, लक्ष्य प्रोटीन या प्रोटीन परिसर के मापा बहाव समय सही: 7 समीकरण
  12. लक्ष्य / प्रोटीन प्रोटीन जटिल घातीय कारक, एक्स, चरण 7 में परिभाषित का उपयोग कर के बहाव समय जांचना: 8 समीकरण
  13. लक्ष्य / प्रोटीन प्रोटीन फिट निर्धारित निरंतर का उपयोग जटिल Ω, एक चरण 7 में परिभाषित की गणना: 9 समीकरण .
  14. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, चरण 2 से 13 दोहराया जाना चाहिए. जब अज्ञात प्रोटीन या प्रोटीन जटिल के क्रॉस अनुभागीय क्षेत्र को परिभाषित करने, हम अनुशंसा करते है कि प्रत्येक प्रयोग कम से कम तीन बार दोहराया जा, और इन तीन प्रतियों माप की मानक विचलन निर्धारित है.

भाग 4: बहाव समय मानों को परिभाषित

आवश्यक सॉफ्टवेयर: MassLynx और Driftscope (वाटर्स).

  1. IM एमएस स्पेक्ट्रम Driftscope सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खोलें.
  2. मुख्य मेनू से, VI चुनेंew और अचयनित Chromatogram, बहाव समय और स्पेक्ट्रम (वैकल्पिक), सक्रिय केवल 2 डी मीटर / जेड बनाम बहाव समय प्रदर्शित नक्शा छोड़ने
  3. विकल्प | | मेनू पट्टी से, प्रदर्शन चुन प्रदर्शन संपादक पैनल और तीव्रता थ्रेसहोल्ड मान को समायोजित करने के लिए पृष्ठभूमि शोर कम से कम (ज्यादातर मामलों में, इस सेटिंग को न्यूनतम = 30-40% और अधिकतम = 100% मायने रखता है के रूप में परिभाषित किया जा सकता है).
  4. प्रदर्शित चुनें | 2D नक्शा तीव्रता, स्केल, और तीन विकल्प दिखाई देगा: रैखिक स्केल, स्केल प्रवेश और स्क्वायर रूट स्केल. प्रवेश करें स्केल (लघुगणक डेटा को बदलने) के एक विकल्प तीव्रता रंग कोड सेक, और तीव्रता का एक व्यापक रेंज के युगपत उपस्थिति सक्षम (के रूप में रैखिक और वर्गमूल विकल्प विरोध करने के लिए, जिसके साथ केवल सबसे तीव्र चोटियों दिखाई हो जाएगा) .
  5. उपकरण पट्टी पैनल से चयन उपकरण बटन का प्रयोग करें. यह विकल्प विभिन्न चयन के विकल्पों को सक्रिय होगा, और स्पेक्ट्रम के भीतर प्रासंगिक क्षेत्र का चयन सक्षम. सबसे सटीक उपकरण ब्याज चयन के क्षेत्र का मतलब है जो की एक सीमा हित के क्षेत्र के आसपास तैयार किया जा सकता है, जिससे सभी अनावश्यक डेटा और शोर चोटियों को छोड़कर, सक्षम है. इसी तरह, विषयेतर और बैंड चयन विकल्प उपयोगी होते हैं, जब ब्याज के क्षेत्र बेमानी चोटियों से घिरा हुआ है.
  6. एक बार ब्याज के क्षेत्र चयनित होता है, वर्तमान चयन आदेश स्वीकार करने के लिए उपयोग करने के लिए अनावश्यक जानकारी निकालने के लिए.
  7. MassLynx करने के लिए डेटा निर्यात, जबकि बहाव समय की जानकारी को बनाए रखना.
  8. MassLynx भीतर बचाया बहाव समय स्पेक्ट्रम के chromatogram खोलते हैं, और समय के डिब्बे गठबंधन. इसी जन स्पेक्ट्रम स्वतः ही खुल जाएगा.
  9. परिभाषित विंडो का आकार और चिकनी पैरामीटर की संख्या (प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए विशेष रूप से देखते करना चाहिए, कम से कम मानों का उपयोग) द्वारा smoothening समारोह लागू करें.
  10. आधारभूत घटाव लागू करें, यदि आवश्यक.
  11. केंद्र स्पेक्ट्रम और बड़े पैमाने पर मापने के लिए, प्रोटीन की पहचान और जन सटीकता को मान्य.
  12. प्रत्येक प्रभारी राज्य के लिए, सीमा मी / z गठबंधन. इसी बहाव समय स्पेक्ट्रम स्वचालित रूप से दिखाई देगा. चिकना और केंद्र बहाव समय, प्रोफ़ाइल, और प्रत्येक चोटी के केन्द्रक संकेत द्वारा बहाव समय मान को परिभाषित.

भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. Synapt HDMS आईएमएस एमएस अधिग्रहण के प्रमुख tunable मापदंडों का संकेत लिखत के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रायोगिक IM एमएस माप के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों साधन के भीतर अपनी स्थिति के अनुसार लेबल रहे हैं. आयन बीम लाल रंग में रंग है, और प्रत्येक क्षेत्र में दबाव एक रंग कोड का उपयोग करने के लिए नामित है. तल पर पैनल साधन और संभावित जाल और स्थानांतरण टक्कर ऊर्जा के रूप में अच्छी तरह से पूर्वाग्रह संभावित परिभाषित मतभेद के साथ संभावित ढाल दिखाता है. सभी पढ़ने पीठ क्षमता स्टेटिक ऑफसेट वोल्टेज है जो आमतौर पर 120V के लिए सेट कर दिया जाता है को संदर्भित कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. आयन Gβυ प्रोटीन के लिए गतिशीलता आगमन समय वितरण .

एक उच्च वेग टी लहर बहाव समय प्रोफाइल के एक संकीर्ण वितरण होता है. साजिश के आगमन के समय वितरण दिखाता है 16 + (लाल) + 15 (हरा), 14 + (नीला), और 13 + (मैजंटा) प्रभारी राज्यों के रूप में अच्छी तरह से जी βυ प्रोटीन की कुल बहाव समय प्रोफ़ाइल (काले रंग में) के रूप में.

बी एक चिकनी गाऊसी चोटी के आकार के साथ एक अनुकूलित बहाव समय स्पेक्ट्रम. एक में इसी तरह के रंग लेबल.

सी. ए 'रोल से अधिक प्रभाव है, जो तब होता है जब आयनों के लिए ले जाया करने के लिए गतिशीलता सेल पार समय नई डिवाइस में आयन पैकेट इंजेक्शन के बीच के अंतराल की तुलना में धीमी है. एक परिणाम के रूप में विस्तारित बहाव समय चोटी स्पेक्ट्रम के शुरुआत में प्रकट होता है. इस आशय की टी - लहर ऊंचाई बढ़ रही है, और टी तरंग वेग और आईएमएस दबाव कम करने के द्वारा समाप्त किया जा सकता है.

डी. कृत्रिम 'लहर' जब स्थानांतरण टी लहर वेग और ढकेलनेवाला आवृत्ति आंशिक रूप से सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं कारण हैं. इस आशय ढकेलनेवाला या तो आवृत्ति या स्थानांतरण टी लहर वेग का समायोजन करके दूर किया जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. आयन सक्रियण और हीमोग्लोबिन की IM एमएस स्पेक्ट्रा पर आंशिक denaturing शर्तों के प्रभाव / tetrameric हीमोग्लोबिन जटिल के लिए z मीटर बनाम समय बहाव के प्लॉट, 10 मिमी अमोनियम एसीटेट की एक जलीय घोल का उपयोग कर (पीएच = 7.6) (ए, सी) और 0.1% एसिटिक एसिड (बी) के अलावा. 13 वी (बी ए,) के जाल टक्कर ऊर्जा वोल्टेज और 35 वी (सी), हालांकि सभी तीन पैनलों में जन स्पेक्ट्रम (शीर्ष पर अनुमानित) के समान लग रहा है एक tetrameric शुल्क 4,000 / मीटर z पर केंद्रित श्रृंखला के साथ, का उपयोग कर डेटा का अधिग्रहण बहाव समय प्रोफ़ाइल (पक्षों पर अनुमानित) अलग (कुल बहाव समय वितरण हैकाले रंग में है, और 16 + प्रोफ़ाइल लाल रंग में है). अब बहाव आंशिक रूप से विकृत नमूना के समय, बी में प्राप्त है, और गैस चरण सक्रिय आयनों, सी में प्राप्त खुलासा के कुछ डिग्री के संकेत है. इस अवलोकन दिखाता है कि भले ही बड़े पैमाने पर मापा एक अक्षुण्ण परिसर से मेल खाती है है, इसके समाधान संरचना बाधित है. एक परिणाम के रूप में, प्रयोगात्मक शर्तों के सावधान नियंत्रण की आवश्यकता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. एक अंशांकन वक्र पैदा करके, समय मापन बहाव और टक्कर - पार वर्गों सहसंबद्ध किया जा सकता है.

घोड़ा साइटोक्रोम हलकों (सी), घोड़े दिल (त्रिकोण) मायोग्लोबिन और ubiquitin गोजातीय (वर्ग) के एकाधिक प्रभारी राज्यों के समय मानों बहाव मापा साहित्य Ω दोनों आयन प्रभारी राज्य और कम द्रव्यमान के लिए सही मूल्यों के खिलाफ प्लॉट थे . ln (Ω सी) = XLN (टी डी ') + A: फिट पैदावार एक रैखिक करने के लिए इसी समारोह निर्धारित घातीय कारक (एक्स), फिट निर्धारित निरंतर (ए), और सहसंबंध गुणांक 350 m / s के एक टी लहर वेग, और 11 वी. बी के एक स्थिर लहर ऊंचाई पर प्राप्त डेटा के लिए भूखंड पर प्रदर्शित होते हैं. सहसंबंध गुणांक के वितरण का एक हिस्टोग्राम लगातार 10 अंशांकन प्रयोगों से प्राप्त की.

प्रोटीन नमूना / तकनीकी पैरामीटर GluFibrino -
पेप्टाइड
monomer
1.6 केडीए
Myoglobin

monomer
17 केडीए
हीमोग्लोबिन

tetramer
67 केडीए
Transferrin

monomer
80 केडीए
GroEL

14 पूर्व
801 केडीए
का बैकअप लेने के दबाव, mbar 4.4 5.0 5.1 5.1 6.5
ट्रैप दबाव, mbar 1.6x10 -2 2.4x10 -2 2.4x10 -2 2.6x10 -2 2.8x10 -2
आईएमएस दबाव, mbar 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.2x10 -1
नमूनाकरण शंकु वोल्टेज, वी 46 80 80 80 118
एक्सट्रैक्शन शंकु वोल्टेज, वी 1.7 1 1 1 3
पूर्वाग्रह वोल्टेज, वी 20 20 25 25 50
ट्रैप टक्कर ऊर्जा, वी 20 15 15 15 80
स्थानांतरण टक्कर ऊर्जा, वी 5 12 12 12 15

तालिका 1 प्रायोगिक बड़े अणुओं के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया शर्तें .

मानक प्रोटीन आण्विक मास (एम) प्रभार (z) मी / Z टकराव की क्रॉस - धारा (2 में)
साइटोक्रोम सी 12213 10 1222.3 2226
11 1111.3 2303
12 1018.8 2335
13 940.5 2391
14 873.4 2473
15 815.2 2579
16 764.3 2679
17 719.4 2723
18 679.5 2766
Myoglobin 16952 11 1542.1 2942
12 1413.7 3044
13 1305.0 3136
14 1211.9 3143
15 1131.1 3230
16 1060.5 3313
17 998.2 3384
18 942.8 3489
19 893.2 3570
20 848.6 3682
21 808.2 3792
22 771.6 3815
Ubiquitin 8565 8 1071.6 1442
8 1071.6 1622
9 952.7 1649
10 857.5 1732
11 779.6 1802

तालिका 2 Calibrant प्रोटीन और उनके टक्कर पार वर्गों पारंपरिक आईएमएस 14 measurments द्वारा निर्धारित मूल्यों.

औज़ार कंपनी सूचीपत्र संख्या
Synapt HDMS-32K आरएफ जनरेटर वाटर्स लिमिटेड
P-97 ज्वलंत ब्राउन micropipette डांड़ी Sutter उपकरण P-97
Coater धूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान EMS550
द्विनेत्री माइक्रोस्कोप Nikon
अभिकर्मकों कंपनी सूचीपत्र संख्या
अमोनियम एसीटेट सिग्मा Aldrich सिग्मा, A2706
99.999% सीएसआई सिग्मा Aldrich Aldrich, 203033
मेथनॉल सिग्मा Aldrich Fluka, 34966
एसिटिक एसिड फिशर साइंटिफिक AC12404
इक्वाइन मायोग्लोबिन (घोड़े दिल से) सिग्मा Aldrich M1882
इक्वाइन साइटोक्रोम ग (घोड़े दिल से) सिग्मा Aldrich सी २५०६
Ubiquitin गोजातीय (लाल रक्त कोशिकाओं से) सिग्मा Aldrich U6253
हीमोग्लोबिन सिग्मा Aldrich H2625
गैस टिप्पणियाँ
नाइट्रोजन, 99.999% शुद्ध 8 घन मीटर सिलेंडर
आर्गन, 99.999% शुद्ध 8.8 घन ​​meterscylinder

तालिका 3 अभिकर्मकों और उपकरण.

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित करने के लिए उनके समग्र आकार, सबयूनिट पैकिंग और टोपोलॉजी पर जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के साथ एक अज्ञात तीन आयामी संरचना के साथ प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों की टक्कर पार अनुभाग को परिभाषित सक्षम बनाता है. यह अंत करने के लिए एक बार टक्कर पार अनुभाग मूल्यों चित्रित कर रहे हैं यह संरचनात्मक विवरण के लिए इन मूल्यों को बदलने के लिए आवश्यक है. इस प्रक्रिया में अतिरिक्त प्रयोगात्मक रूप में अच्छी तरह के रूप में कम्प्यूटेशनल विश्लेषण है, जो नीचे संक्षेप में चर्चा कर रहे हैं प्रयासों की आवश्यकता है.

साथ शुरू करने के लिए, यह ज्ञात संरचनाओं के साथ प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है. इन माप पद्धति का एक उपयोगी गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं और सैद्धांतिक और मापा मूल्यों Ω की तुलना द्वारा अधिग्रहण मापदंडों की सटीकता का मूल्यांकन सक्षम हो जाएगा. सैद्धांतिक क्रॉस अनुभागीय क्षेत्रों क्रिस्टल संरचना से गणना की जा सकती MOBCAL 15,16 सॉफ्टवेयर, जो एक खुला स्रोत फोरट्रान आधारित सॉफ्टवेयर ऑपरेटर की जरूरत के अनुसार कोड संपादन की अनुमति है का उपयोग कर निर्देशांक है. ऐसी गणना चलाने के लिए यह आवश्यक है कि इनपुट संरचना प्रति प्रदर्शन पुनरावृत्त गणना की संख्या में वृद्धि हुई है और समन्वय परमाणुओं की बड़ी संख्या से युक्त फ़ाइलों 1 स्वीकार किए जाते हैं कि ऐसे कार्यक्रम को संशोधित.

Multicomponent असेंबलियों के भीतर सब यूनिटों के topological व्यवस्था को परिभाषित करने के लिए एक रणनीति IM एमएस हाल ही में किया गया है 4,6 प्रस्तावित है. विधि छोटे घटकों के लिए प्रोटीन असेंबलियों के पृथक्करण रास्ते की निगरानी शामिल है. इस पृथक्करण समाधान चरण शर्तों के नियंत्रित समायोजन, जो विधानसभाओं के "इमारत ब्लॉकों" के चिंतनशील subcomplexes के वितरण को जन्म देता है है के माध्यम से हासिल की है. Ω दोनों बरकरार जटिल और disassembly उत्पादों के मूल्यों के युगपत माप संरचनात्मक मजबूरी है जो तब प्रोटीन परिसरों के topological मॉडल की गणना के लिए इस्तेमाल किया जाता है उत्पन्न करता है. बुनियादी इस पद्धति अंतर्निहित धारणा यह है कि उत्पन्न subcomplexes उनके देशी तरह पुष्टियों को बनाए रखने, और वास्तव में हाल के अध्ययनों से दिखा दिया है कि disassembly के उत्पादों के समाधान संरचना को बनाए रखा है और या तो समाधान या गैस चरणों में कोई प्रमुख पुनर्व्यवस्था 4,6 हुई है.

गैस चरण प्रोटीन जटिल आयनों चतुर्धातुक संरचना के काम में पिछले कदम टक्कर पार अनुभाग मूल्यों कंप्यूटर जनित मॉडलों के लिए उचित है. मॉडलिंग दृष्टिकोण के क्रम में सब यूनिटों के विभिन्न संभव topological व्यवस्था और सिलिको Ω मूल्यों में उनकी गणना कर रहे हैं और प्रयोगात्मक लोगों की तुलना में पता लगाने के लिए नियोजित कर रहे हैं . वर्तमान में केवल कुछ कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण, spheretype भोंडा तरीका है कि 1,8 सब यूनिटों का व्यास approximates की तरह इस्तेमाल कर रहे हैं. पूरे पर, अपने प्रारंभिक वर्षों में इस क्षेत्र में अभी भी है और आगे विकास के लिए इस दृष्टिकोण सामान्य है, और परिसरों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू करने की आवश्यकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

लेखकों उनके महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए, और पांडुलिपि के लिए अपने योगदान के लिए शेरोन समूह के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. हम Morasha और Bikura प्रोग्राम्स, इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान नग 1823-1807 और 378/08), जोसेफ Cohn मिनर्वा Biomembrane अनुसंधान के लिए केंद्र, नई वैज्ञानिकों के लिए Chais परिवार फैलो प्रोग्राम, इब्राहीम के समर्थन के लिए आभारी हैं और सोनिया Rochlin फाउंडेशन, वोल्फसन परिवार चैरिटेबल ट्रस्ट, हेलेन और मिल्टन ए Kimmelman केंद्र Biomolecular संरचना और विधानसभा के लिए, Shlomo और Sabine Beirzwinsky की संपत्ति, Meil ​​डे Botton Aynsley, और करेन Siem, ब्रिटेन.

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