T-vågen Ion Mobility-masspektrometri: Grundläggande experimentell Rutiner för Protein Komplex analys

Biology
 

Summary

Ion rörlighet-masspektrometri är ett framväxande gasfas teknik som separerar joner, baserat på deras kollision tvärsnitt och massa. Metoden ger tredimensionella information om de övergripande topologi och form av protein komplex. Vi presenterar här ett grundläggande proceduren för instrument inställning och optimering, kalibrering av drift gånger, och tolkning av data.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis. J. Vis. Exp. (41), e1985, doi:10.3791/1985 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ion rörlighet (IM) är en metod som mäter den tid det tar för en jon att resa genom ett trycksatt cell under påverkan av en svag elektrisk fält. Den hastighet med vilken joner korsa driver regionen beror på deras storlek: stora joner kommer att uppleva ett större antal kollisioner med bakgrunden inert gas (vanligtvis N 2) och därmed resa mer långsamt genom IM-enheten än de joner som utgör en mindre tvärsnitt. I allmänhet, den tid det tar för jonerna att migrera trots den täta gasfas separerar dem, enligt deras kollision tvärsnitt (Ω).

Nyligen var IM spektrometri kombination med masspektrometri och en resande-våg (T-våg) Synapt jon rörlighet masspektrometer (IM-MS) släpptes. Integrera masspektrometri med jon rörlighet ger en extra dimension av prov separation och definition, vilket ger en tredimensionell spektrum (massa att ladda, intensitet och drift tid). Denna separationsteknik ger spektral överlappning att minska, och möjliggör upplösning av heterogena komplex med mycket liknande massa, eller massa och laddning nyckeltal, men olika tider drift. Dessutom driver tiden mätningarna ger ett viktigt lager av strukturell information, eftersom Ω är relaterad till den övergripande formen och topologi av jon. Korrelationen mellan de uppmätta värdena glida tid och Ω beräknas med hjälp av en kalibreringskurva som genereras från kalibreringsvätska proteiner med definierade tvärsnitt 1.

Kraften i IM-MS metoden ligger i dess förmåga att definiera den underavdelning packning och övergripande form av protein enheter vid mikromolära koncentrationer, och nära fysiologiska förhållanden 1. Flera nya IM studier av både enskilda proteiner 2,3 och icke-kovalenta komplex protein 4-9, framgångsrikt visat att protein kvartära struktur bibehålls i gasfas, och visat vilka möjligheter detta tillvägagångssätt i studien av protein sammansättningar av okänd geometri . Här ger vi en detaljerad beskrivning av IMS-MS-analys av protein komplex med Synapt (kvadrupol-Ion Mobility-Time-of-flight) HDMS instrument (Vatten AB, den enda kommersiella IM-MS-instrument som för närvarande finns tillgänglig) 10. Vi beskriver de grundläggande optimering steg, kalibrering av kollision tvärsnitt, och metoder för databearbetning och tolkning. Det sista steget i protokollet diskuterar metoder för att beräkna teoretiska Ω värden. Sammantaget gör försök protokollet inte täcker alla aspekter av IM-MS karakterisering av protein församlingar, utan är dess mål att introducera de praktiska aspekterna av metoden till nya forskare inom området.

Protocol

Förfarandet beskriver vi fokuserar enbart på IM-MS-analys av protein komplex. Därför föreslår vi att forskarna obekant med området strukturella MS Se stegen provberedning, instrumentkalibrering och MS och tandem MS optimering som beskrivs i Kirshenbaum et al. 2009 http://www.jove.com/index/details. STP? ID = 1954. I allmänhet innebär detta protokoll låga mikromolära koncentrationer av komplexa (1-20 M) i en flyktig buffert som ammoniumacetat (0,005 - 1 m, pH 6-8). Med tanke på att 1-2 l förbrukas per nanoflow kapillär, föreslår vi 10-20 l som ett minimum volym, för att möjliggöra optimering av MS villkor.

Del 1: Förvärva ett jon rörlighet-masspektrometri spektrum

  1. Ställ masspektrometer på följande driftlägen: Mobility-TOF, positiv jon förvärv, och V-läge.
  2. Slå på alla gaser (API, Trap och IMS). Vi använder N 2 för IM separation, och Ar för Trap / Transfer. Rekommenderad initial värden är 1,5 ml / min för Trap regionen och ett gasflöde på 24 ml / min för IMS-enheten.
  3. Ställ m / z förvärvet sortiment. För ett okänt protein komplex, föreslår vi att första användningen av en bred massa sortiment, som sedan kan reduceras till önskade värden. Parallellt justera MS profilen för maximal verkningsgrad. För stora komplex, bör förvärvet viktområde ställas in från 1.000 - 32.000 m / z, och medlemsstaterna profil på Auto. Annars kan profilen ställas in, enligt följande tabell:
    m / z bo (%) ramp (%)
    960 10 20
    3200 30 40
    10.667
  4. Kontrollera RF-inställning och, om nödvändigt, anpassa sig till värden lämpliga för stora proteinkomplex, sålunda:
    Källa Trap IMS Överföring
    RF Offset 450 380 380 380
    RF Gain 0 0 0 0
    RF-Limit 450 380 380 380
  5. Applicera kapillär spänning (1,050-1,400 V) och låg nanoflow tryck (från 0,00 till 0,03 bar). När spray är initieras, försöka minska nanoflow trycket till ett mycket lågt värde. Dessutom, justera placeringen av kapillär, med avseende på konen.
  6. Justera MS förvärvet parametrarna, att förvärva en väl löst MS spektrum: det tryckgradienten längs instrumentet och provtagning konen samt utvinning konen bör bias, Trap och Transfer potentiella inställningarna, allt optimeras (beskrivna i det JUPITER-protokollet Kirshenbaum et al. 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954). Även om dessa parametrar är prov-beroende, är de villkor som vi använde för att skaffa MS spektra av olika jon massa från peptid till protein komplex, beskrivs i tabell 1 (se även bild. 1). För att minimera aktiveringen av de komplexa försöker att gradvis minska (i steg om ~ 10 V) provet konen, Trap och bias spänning utan att ändra position topp.
  7. När en optimal masspektrum erhålls drivan tidsprofil bör justeras. Vid analys av protein församlingar optimala förutsättningar för både vikt och mått rörlighet är ofta oförenliga, och därför är det viktigt att hitta den rätta balansen mellan de två. Sammantaget bör jon rörlighet tomten optimeras så att topparna är fördelade över hela glida tidsintervall och maximal profilen är slät, närmar sig en normalfördelning (Fig. 2A, 2B). Betydande topp asymmetri kan relateras till dålig separation av flera konformationer.
  8. Som regel kan tre parametrar, T-våg hastighet, T-våghöjd och IMS Gasflödet ställas in för att optimera rörlighet separation. Öka T-vågen hastigheten kommer att bredda glida profilen tiden distribution, samtidigt som ökad T-våghöjd värden kommer att minska det. På samma sätt kommer att öka IMS gasflödet skifta profil glida tiden mot högre värden (den minimala IMS gasflödet skall vara 10 ml / min). Vi föreslår att lämna två av de tre fasta tillgängliga variabler, och optimera den tredje tills IM spektrum är väl löst (Fig. 2B). För detta ändamål ställa T-vågen hastighet och gasflödet till 250 m / s och 24 ml / min, åternebulosans. Då, som en utgångspunkt, som T-våghöjden till 3 V och, i flera steg, öka den i 1 V steg. I allmänhet kommer större joner kräver högre våghöjder. Vanligtvis finns det ingen anledning att ändra IMS-trycket, men är då höga partiskhet spänning som krävs för trimning, minska IMS gasen kommer att möjliggöra en minskning av partiskhet spänning och därmed en minskning av proteinkomplex aktivering. Sammantaget kan maximal upplösning på 10-12 ton / Dt nås.
  9. När förhållandena inte är optimerade (låg T-våghöjd eller hög T-våg hastighet och / eller högt IM tryck), kommer jonerna färdas inte genom IM-enheten effektivt, och resan kan ta längre tid än den tid som krävs för nästa jon paket som ska ut i rörlighet cellen. Som ett resultat kommer en ny jon paket släppas ur fällan regionen innan föregående paket har levererats till pusher regionen. Detta kommer att leda till en "roll-over" effekt, där topp observeras i den första delen av avdrift tiden spektrumet är identisk med den i joner i avfallsdammen kanten (Fig. 2C). Denna artefakt kan elimineras genom att öka T-våghöjden, och minskar T-vågen hastighet och IMS tryck. Dessutom kan Trap frigöra tid justeras. Dessutom är det viktigt att validera att överföringen T-våghöjden är satt till minst 5 V. För att förhindra läckage av joner mot IMS-cellen, rekommenderar vi att rörligheten fällan höjden hållas på högsta tillåtna halter (30 V).
  10. Låg hastighet och hög amplitud Transfer T-vågor kan leda till "porlande" av drift tid Distribution Profile (Fig. 2D). Denna artefakt uppstår när rörligheten separation av joner (jon ankomst / drift tid) inte upprätthålls genom överföring och regioner SP, på grund av partiella synkronisering mellan pusher frekvens och överföring T-vågen hastighet. För att eliminera denna effekt, antingen pusher tid eller Transfer T-vågen hastigheten justeras. Eftersom pusher frekvensen är relaterad till massan sortiment, kan denna artefakt visas igen när denna parameter ändras. T-våghöjd utövar en mindre effekt, även om dess minskning kan också bidra till att eliminera ringar på vattnet.
  11. När de ovan nämnda parametrar har optimerats, kan IM-MS uppgifterna hämtas.

Del 2: Screening experimentella förhållanden för att säkerställa rörlighet mätningar av infödda strukturer

För att uppnå mycket löst MS toppar, är proteinkomplex ofta aktiveras inom masspektrometer, för att främja strippning av kvarvarande vatten och komponenter buffert 11. Men om aktiveringsenergi höjs över ett tröskelvärde, kan delvis utspelas förmås att bilda flera mellanliggande stater 12, som förmodligen inte att motsvara de infödda, lösning state struktur (Fig. 3A-C). Som ett resultat kan glida tiden topp flyttas och breddas, vilket speglar den heterogena befolkningen i ovikt strukturer.
För att få fram uppgifter glida tid överensstämmer med lösning-fas strukturer är det viktigt att noggrant kontrollera de spänningar som används för att accelerera joner, innan IM separation. Dessutom för hög ms upplösning det är bättre att öka överföringen snarare än Trap spänning. Som IM-enheten är placerad, först, följt av överlåtelsen regionen och TOF analysator, därav följer aktivering IM mätning och jonerna förblir opåverkad, medan MS noggrannheten kan ökas.

För att kontrollera att datainsamling sker under förhållanden som behåller den ursprungliga strukturen av komplexa, rekommenderas att data registreras över en rad experimentella och lösning villkor, snarare än enligt en enda, optimerad uppsättning parametrar:

  1. Öka kapillär och konen spänningar i flera steg, medan övervakningen av effekten på drift tid spektrumet.
  2. Som i steg 1, öka spänningen Trap kollision i flera steg och få uppgifter vid 10 V mellanrum.
  3. För att identifiera ovikt konformationer och bedöma de förvärvade data manuellt framkalla dissociation av proteinkomplex genom upptitrering av provet med ättiksyra över en vidd av pH 2-7, och registrera data (Fig. 3B).

Del 3: Korrelera mellan värderingar glida tid och tvärsnittsareor

Till skillnad från konventionella IM mätningar, där den uppmätta drift tidsvärden är linjärt relaterade till Ω, i T-vågen IMS-system är tvärsnittsarea definieras av en kalibrering strategi. Således, snarare än ett absolut mått, är en relativ exponentiell korrelation uppstår mellan den uppmätta driver gånger och Ω 1,13: Ekvation 1

där t D är den uppmätta drift tid, och X är andelen konstant som kan utvinnas ur en kalibreringskurva. Kalibreringen är utföraED genom att mäta drift tider av joner med kända Ω (mätt från konventionellt IM experiment).

  1. Drift tid mätningar kalibreras med hjälp denatureras proteiner häst cytokrom C, häst hjärta myoglobin och nötkreatur ubiquitin med kända kollision-tvärsnitt. För detta ändamål lösningar av 10 mikrometer i 49/49/2, volym förhållandet, bör vatten / metanol / ättiksyra vara beredd (reagenser beskrivs i tabell 3).
  2. Förvärva IM-MS data för kalibreringsvätska proteiner under exakt samma instrument villkor för målet protein eller proteinkomplex: Ekvation 7 (Del 1). Alla spänningar och värden trycket bör vara identiska, för att bevara IM separation inställningar.
  3. För varje laddningstillstånd för kalibreringsvätska proteiner extrahera experimentella värdet glida tiden (t D) (beskrivs i del 4).
  4. Korrekt varje kalibreringsvätska drift gånger (t D) (tabell 2) med hjälp av följande ekvation: Ekvation 2 , Där m / z är massan och laddning förhållandet mellan observerade jon, och c är Enhanced Driftscykel (EDC) fördröjning koefficienten 1. Dess värde, vanligtvis mellan 1,4 och 1,6, är instrument-beroende. EDC-värdet visas i systemet | Förvärv Inställningar | Acquisition Setup fliken.
  5. Använda professor David Clemmer tvärsnitt Database:
    http://www.indiana.edu/ ~ Clemmer / Forskning / cross% 20section% 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 rätt varje kalibreringsvätska tvärsnitt för både jon laddningstillstånd och minskad massa. Ekvation 3
    , Där Ω C är den korrigerade tvärsnitt är Ω litteraturen tvärsnitt är z jon laddningstillstånd, M är molekylvikt kalibreringsvätska jon, och M G är molekylvikt IM bakgrunden gas (vanligtvis N 2).
  6. Tomt I (t D) mot I (Ω C) (Fig. 4A).
  7. Den resulterande kurvan motsvarar följande ekvation: Ekvation 4 Parametrarna X och A kan utvinnas genom att montera tomten till ett linjärt samband. Lutningen X motsvarar den exponentiella andelen faktor och en representerar den passar bestämda konstant.
  8. Beräkna passar korrelationskoefficienten r 2, med hjälp av Pearsons ekvation: Ekvation 5 . Godtagbara värden för r 2 är större än 0,95 (Fig. 4B). Ett lägre korrelationskoefficient värde kan bero på:
    1. Ofullständig utbredning av proteinet kalibreringsstandarderna. Detta kommer att leda till topp bredda på grund av den heterogena sammansättning av mellanliggande stater.
    2. Enligt vår erfarenhet kan en äldre prov försämras IM spektra.
    3. Olika experiment som används för de olika kalibreringsstandard proteiner. I det här fallet plotta data för varje protein separat bör generera olika korrelationskoefficienter, om var och en av dem bör vara högre än 0,95.
    4. Noisy data och felaktiga utjämning och centrering av drift tid distributionen.
    5. Räknefel.
  9. Recorrect den kalibreringsvätska glida tiden med fastställda exponentiell faktor X, härrör i steg 7: Ekvation 8
  10. Som en validering steg Replot Ω C vs Ekvation 10 och definiera korrelationskoefficienten. Högre värden än 0,95 är att vänta.
  11. Enligt det förfarande som beskrivs i steg 4, korrigera den uppmätta glida tiden för målet protein eller proteinkomplex: Ekvation 7
  12. Kalibrera drift tiden för målprotein / proteinkomplex med hjälp av exponentiell faktor X, som definieras i Steg 7: Ekvation 8
  13. Beräkna Ω av målet protein / protein komplex med plats bestämd konstant, A, som definieras i Steg 7: Ekvation 9 .
  14. För varje experimentell skick, 2 till 13 steg ska upprepas. När man definierar tvärsnittsarea det okända protein eller proteinkomplex, rekommenderar vi att varje försök att upprepas minst tre gånger, och standardavvikelsen för dessa tre exemplar bestämda.

Del 4: Definiera värden glida tid

Obligatorisk programvara: MassLynx och Driftscope (vatten).

  1. Öppna IM-MS spektrat med Driftscope programvara.
  2. Från huvudmenyn, välj ViEW och avmarkera Kromatogram, Drift Tid och Spectrum (tillval), vilket endast aktiv 2D-kartan visar glida tid vs m / z.
  3. Från menyraden, välj Visa | Alternativ | Visa Redaktör Panel och justera värdena intensitet Tröskeln för att minimera bakgrundsljud (i de flesta fall kan denna inställning definieras som Min = 30-40% och Max = 100 räknas%).
  4. Välj Visa | 2D Skala Karta intensitet och tre alternativ visas: linjär skala, Logga Skala och Square Root Skala. Ett urval av Log Scale (logaritmisk uppgifter transform) komprimerar koden intensitet färg och möjliggöra samtidiga ett brett utbud av intensiteter (i motsats till den linjära och kvadratrot alternativ, som endast de mest intensiva topparna blir synlig) .
  5. Från verktygsfältet panelen, Använd knappen Selection Tool. Detta alternativ kommer att aktivera de olika valmöjligheter, och aktivera urval av de berörda regionen inom spektrumet. Den mest exakta verktyget är Aktivera regionen av intresse val, genom vilka en gräns kan dras runt om i regionen av intresse, och därmed utesluter alla onödiga data och toppar buller. Likaså Ortogonal och Band Val alternativen är bra, då regionen av intresse inte är omgiven av redundanta toppar.
  6. När regionen av intresse är vald, använd Acceptera Aktuella Urval kommando för att ta bort onödig information.
  7. Exportera data till MassLynx, men behåller informationen glida tiden.
  8. Inom MassLynx, öppna kromatogrammet för den sparade glida tid spektrum, och kombinera den tiden papperskorgar. Motsvarande masspektrum öppnas automatiskt.
  9. Applicera smoothening funktionen genom att definiera fönstrets storlek och antal smidig parametrar (bör anpassas specifikt för varje spektrum, med minimal värden).
  10. Applicera baslinjen subtraktion, om det behövs.
  11. Centrera spektrum och mäta massan, att validera protein identitet och massa noggrannhet.
  12. För varje laddningstillstånd, kombinera med m / z sortiment. Motsvarande driver tiden spektrum visas automatiskt. Smidig och centrera glida tiden profil och definiera värdet glida tiden genom att ange centroiden för varje topp.

Del 5: representativa resultat

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av Synapt HDMS instrumentet som visar de stora avstämbara parametrar för IMS-MS förvärvet. Experimentella parametrar som används för IM-MS mätningar är märkta i enlighet med deras position i instrumentet. Den jonstrålar är färgad i rött, och trycket i varje region har utsetts med hjälp av en färgkod. Panelen på botten visar på den potential gradient längs instrumentet och eventuella skillnader som definierar Trap och överföring av energier kollision liksom Bias potential. Alla potentialer läsa-backs refereras till Static offsetspänning som vanligtvis är inställd på 120V.

Figur 2
Figur 2. Ion rörlighet ankomsttid distributioner för Gβυ protein.

A. En hög t-vågen hastighet leder till en smal fördelning av drift tiden profilen. Tomten illustrerar fördelningen ankomsttid för 16 + (röd), 15 + (grön), 14 + (blå), och 13 + (magenta) laddning stater, liksom den totala drift tid profil (i svart) i G βυ protein.

B. En optimerad drift tid spektrum med en mjuk Gaussisk topp form. Liknande färgetiketter som i en.

C. En "roll-over" effekt som uppstår när den tid det tar för joner att korsa rörlighet cellen är långsammare än intervallet mellan injektioner av nya jon-paket i enheten. Som ett resultat visas den förlängda glida tiden topp i början av spektrumet. Denna effekt kan elimineras genom att öka T-våghöjden, och minskar T-vågen hastighet och IMS tryck.

D. konstgjord "krusningar" uppstår när Transfer T-vågen hastighet och påskjutning av frekvens är delvis synkroniserade. Denna effekt kan övervinnas genom att justera antingen pusher frekvens eller Transfer T-våg hastighet.

Figur 3
Figur 3. Effekten av jon aktivering och partiell denaturering villkor för IM-MS spektra av hemoglobin. Täppa för avdrift tid jämfört med m / z för tetrameriskt hemoglobin komplex, med en vattenlösning på 10 mm ammoniumacetat (pH = 7,6) (A, C) och tillägg av 0,1% ättiksyra (B). Data som förvärvats med hjälp Trap spänning kollisionsenergi på 13 V (A, B) och 35 V (C) Även i alla tre panelerna masspektrum (projiceras på den översta) ser ut, med en tetrameriskt avgift serie centrerad vid 4000 m / z, drivan tidsprofil (projiceras på sidorna) är annorlunda (total drift tid distributioni svart, och den 16 + profilen är i rött). Ju längre drift tid på delvis denaturerade provet, som erhållits i B, och gasfas aktiveras joner, som erhålls i C, tyder på en viss utbredning. Denna observation visar att även om den uppmätta massan motsvarar en intakt komplex, är dess lösning strukturen störs. Som en konsekvens är noggrann kontroll av experimentella villkor.

Figur 4
Figur 4. Genom att generera en kalibreringskurva, drift tid mätningar och kollision tvärsnitt kan korreleras.

A. Uppmätta värden glida tiden för flera avgiften delstaterna häst cytokrom C (cirklar), häst hjärtat myoglobin (trianglar) och bovin ubiquitin (torg) var plottas mot litteraturen Ω värden korrigerade för både jon laddningstillstånd och minskad massa. Passformen ger en linjär funktion motsvarande: ln (Ω C) = XLN (t D) + A. De fastställda exponentiell faktor (x), montera bestämd konstant (A) och korrelationskoefficient visas på tomten för data förvärvades till en T-våg hastighet av 350 m / s, och en statisk våghöjd på 11 V. B. Ett histogram av distributioner korrelationskoefficienten från 10 på varandra följande kalibrering experiment.

Protein prov / tekniska parametrar GluFibrino-
peptid
monomer
1,6 kDa
Myoglobin

monomer
17 kDa
Hemoglobin

tetramer
67 kDa
Transferrin

monomer
80 kDa
GroEL

14-Mer
801 kDa
Säkerhetskopiera tryck, mBar 4,4 5,0 5,1 5,1 6,5
Trap tryck, mBar 1.6x10 -2 2.4x10 -2 2.4x10 -2 2.6x10 -2 2.8x10 -2
IMS Pressure, mbar 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.4x10 -1 4.2x10 -1
Provtagning kon spänning, V 46 80 80 80 118
Extraktion kon spänning, V 1,7 1 1 1 3
Bias spänning, V 20 20 25 25 50
Trap kollision energi, V 20 15 15 15 80
Överför kollision energi, V 5 12 12 12 15

Tabell 1. Försöksbetingelser som används för analys av makromolekyler.

Standard Protein Molekylmassa (m) Avgifter (z) m / z Kollision tvärsnitt (i 2)
Cytokrom C 12.213 10 1222,3 2226
11 1111,3 2303
12 1018,8 2335
13 940,5 2391
14 873,4 2473
15 815,2 2579
16 764,3 2679
17 719,4 2723
18 679,5 2766
Myoglobin 16.952 11 1542,1 2942
12 1413,7 3044
13 1305,0 3136
14 1211,9 3143
15 1131,1 3230
16 1060,5 3313
17 998,2 3384
18 942,8 3489
19 893,2 3570
20 848,6 3682
21 808,2 3792
22 771,6 3815
Ubiquitin 8565 8 1071,6 1442
8 1071,6 1622
9 952,7 1649
10 857,5 1732
11 779,6 1802

Tabell 2. Kalibreringsvätska proteiner och deras kollision tvärsnitt värden som bestäms med konventionella IMS mätningarna 14.

Enheter Företag Katalognummer
Synapt HDMS-32K RF generator Vatten AB
P-97 Flaming-Brown mikropipetten avdragare Sutter Instrument P-97
Spotta bestrykningsenhet Elektronmikroskopi Sciences EMS550
Binokulärt mikroskop Nikon
Reagenser Företag Katalognummer
Ammoniumacetat Sigma-Aldrich Sigma, A2706
CsI ​​99,999% Sigma-Aldrich Aldrich, 203.033
Metanol Sigma-Aldrich Fluka, 34.966
Ättiksyra Fisher Scientific AC12404
Equine myoglobin (från häst hjärtat) Sigma-Aldrich M1882
Equine cytokrom c (från häst hjärtat) Sigma-Aldrich C-2506
Bovin ubiquitin (från röda blodkroppar) Sigma-Aldrich U6253
Hemoglobin Sigma-Aldrich H2625
Gas Kommentarer
Kväve, 99,999% ren 8 kubikmeter cylinder
Argon, 99,999% ren 8,8 kubikmeter meterscylinder

Tabell 3. Reagenser och utrustning.

Discussion

Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att definiera den del kollision kors proteiner eller proteinkomplex med en okänd tredimensionell struktur, med syfte att ge information om deras övergripande formen, subenhet packning och topologi. För detta ändamål när avsnittet kollisionen över värden är avbildade är det nödvändigt att omvandla dessa värden till strukturella detaljer. Denna process kräver ytterligare experimentella insatser samt beräkningar analys, som kort diskuteras nedan.

Till att börja med, rekommenderas att analysera proteiner eller proteinkomplex med kända strukturer. Dessa mätningar kan ge en nyttig kvalitetskontroll av metoden och kommer att möjliggöra korrekta bedömningen av förvärvet parametrar genom att jämföra teoretiska och uppmätta Ω värden. Den teoretiska tvärsnittsareor kan beräknas från kristallstrukturen koordinater med MOBCAL 15,16 programvaran, som är en öppen källkod FORTRAN baserad programvara som möjliggör kodredigering enligt operatören behöver. För att köra sådana beräkningar är det som krävs för att ändra programmet så att antalet iterativa beräkningar utförs per insatsstruktur ökar och att samordna filer som innehåller ett stort antal atomer accepteras 1.

En IM-MS strategi för att definiera topologiska arrangemang av subenheter inom flerkomponenttextilfibrer församlingar har nyligen föreslagit 4,6. Metoden innebär att övervakningen av dissociation vägar av protein församlingar till mindre komponenter. Denna dissociation sker genom kontrollerad justering av villkor lösning fas, vilket ger upphov till en fördelning av subcomplexes reflekterande av de "byggstenar" i församlingarna. Samtidig mätning av Ω värden av både intakta komplexa och demontering produkter skapar strukturella begränsningar som sedan används för att beräkna topologiska modeller av proteinkomplex. Det grundläggande antagande som ligger bakom denna metod är att den genererade subcomplexes behålla sin infödda-liknande bekräftelser, och faktiskt nyare studier har visat att lösningen struktur demontering produkter upprätthålls och inga större ombildning i någon lösning eller faser gas har inträffat 4,6.

Det sista steget i tilldelningen av kvartära struktur till gasfas proteinkomplex joner är passande kollisionen värden tvärsnittet till datorgenererade modeller. Modellering används för att undersöka de olika möjliga topologiska arrangemang av subenheter och deras in silico Ω värden beräknas och jämförs med experimentella sådana. För närvarande endast ett fåtal beräkningar metoder används, som spheretype grovkorniga metod som efterliknar diameter subenheter 1,8. På det hela taget är detta område fortfarande är i sin tidiga år och ytterligare utveckling krävs för att göra detta tillvägagångssätt generisk, och som gäller för ett brett spektrum av komplex.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Författarna tackar Sharon gruppmedlemmarna för deras kritiska granskning och för deras bidrag till manuskriptet. Vi är tacksamma för stödet från Morasha och Bikura program, Israel Science Foundation (Grant Nos 1823-1807 och 378/08), den Josef Cohn Minerva Centrum för Biomembrane forskning, Chais Familj Fellows program för nya forskare, Abraham och Sonia Rochlin Foundation, den Wolfson Family Charitable Trust, Helen och Milton A. Kimmelman Center för biomolekylär struktur och församlingen, dödsboet efter Shlomo och Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, och Karen Siem, Storbritannien.

References

  1. Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes. Nat Protoc. 3, (7), 1139-1152 (2008).
  2. Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements. Rapid Commun Mass Spectrom. 22, (20), 3297-3304 (2008).
  3. Smith, D. P. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15, (2), 113-130 (2009).
  4. Leary, J. A. Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors. J Am Soc Mass Spectrom. 20, (9), 1699-1706 (2009).
  5. Lorenzen, K. Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly. J Mol Biol. 379, (2), 385-396 (2008).
  6. Pukala, T. L. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17, (9), 1235-1243 (2009).
  7. van Duijn, E. Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry. J Am Chem Soc. 131, (4), 1452-1459 (2009).
  8. Ruotolo, B. T. Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water. Science. 310, (5754), 1658-1661 (2005).
  9. Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. Aspects of native proteins are retained in vacuum. Curr Opin Chem Biol. 10, (5), 402-408 (2006).
  10. Giles, K. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, (20), 2401-2414 (2004).
  11. McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes. J Am Chem Soc. 128, (35), 11433-11442 (2006).
  12. Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes. Angew Chem Int Ed Engl. 46, (42), 8001-8004 (2007).
  13. Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27, (6), 575-595 (2008).
  14. Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections. J Am Soc Mass Spectrom. 10, (11), 1188-1211 (1999).
  15. Mesleh, M. F. Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential. J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).
  16. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics