더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션

Neuroscience

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Summary

이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함

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Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

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Abstract

여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명

Protocol

이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션 세척을 제외하고, 상온에서 실시하는 것입니다. 이 방법에 관련된 모든 단계에 필요한 솔루션 및 버퍼는이 프로토콜의 끝 부분에서 찾을 수 있습니다.

1. 조직 준비 및 Sectioning

  1. 참살 빠르게 주제의 두뇌를 추출하고, 적절한 크기의 플라스틱 금형에 넣습니다.
  2. 조직 테크의 포함 매체와 두뇌를 커버하고 빠르게 빠른 냉동 dry-ice/alcohol 목욕탕에서 플라스틱 금형을 놓으십시오. 냉동 조직은 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다.
  3. 그라 이오 스탯을 사용하여 청구 Superfrost 플러스 슬라이드에 슬라이드 당 2 ~ 3 두뇌 섹션을 수집합니다. 섹션의 두께는 10-12 μm의해야합니다. 슬라이드는 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다.

2. 프로브 정제에 대한 Sephadex G50 열 준비

"Sephadex 컬럼이 상용 소스에서 구입할 수 있지만, 우리는 프로브 정화를 위해 필요합니다 컬럼의 생성을 위해 아래 저가의 대안을 제공합니다.

  1. 상온에서 RNase 무료, DEPC - 처리된 물 (예를 들어, DEPC - 처리된 물 100 ML에 분말 2g), 혼합 솔루션 간략하고 저장과 Sephadex G50 분말의 하이드 레이트 적절한 금액 초과 Sephadex G50을 촉진합니다.
  2. Sephadex G50 강수량 다음 (물을 상위 계층) 뜨는 제거합니다.
  3. 5 회 - 3 위의 과정을 반복합니다.
  4. 최종 세척 후 사용까지 4 Sephadex G50 TE 버퍼 (1:1 비율)에 솔루션 및 저장 ° C를 다시 일시 중지합니다.
  5. 이곳은 살균 한 ML 주사기로 글라스 울을 autoclaved하고 하단에 소형 레이어를 만들기 위해 플런저로 압축하고 15 ML 팔콘 튜브에 주사기를 놓습니다.
  6. 잘 TE에 Sephadex G50의 솔루션을 섞는다. 이 솔루션과 함께 주사기 / 열을 채웁니다.
  7. 1,000 rpm으로 30 초에 대한 컬럼을 원심 분리기.
  8. 칼럼이 거의 Sephadex G50 비즈 가득 때까지이 절차를 반복합니다.
  9. 그 결과 해당 컬럼에 대한 컬럼 세척 버퍼 200 μl를 적용하고 1000 rpm으로 2 분을 위해 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
  10. 그 결과 해당 컬럼에 대한 열의 차단 버퍼 200 μl를 적용하고 1000 rpm으로 2 분을 위해 스핀. 열 평형이 단계 4-5 번 반복합니다. ° C까지 사용 Parafilm와 봉인하면 열이 4 저장할 수 있습니다.

3. Riboprobes의 라벨링 및 정제

우리가 상세 한 riboprobe의 생성 및 정화를 아래. dFISH 각 프로브의 준비 프로브 중 하나가 비오틴 - 태그 UTP와 다른 반면 digoxigenin (발굴) 태그 UTP이 표시됩니다 것을 제외하고, 동일한 방법론을 포함합니다.

  1. 감각 (제어) 또는 안티 센스 riboprobes 중 하나를 생성하는 관심 집중 (> 150 NG / μl)와 정화 선형 cDNA 솔루션을 준비합니다.
  2. 1.5 ML의 microfuge 관에서 cDNA 템플릿, 배 프로브 라벨링 버퍼 2 μl, 10X 파다 1 μl (또는 비오틴) - 라벨 믹스, RNasin 0.5 μl하고 적절한 RNA 효소 1 μl를 정화의 0.5-1 μg을 추가 그리고 RNAse없는 (DEPC - 처리) 물 10 μl로 솔루션의 최종 볼륨을 가지고.
  3. 37 물 목욕에있는 솔루션 ° 2 시간 C를 품어.
  4. 솔루션 및 열 차단 버퍼 39 μl, tRNA 1 μl (20 μg / μl 주식)를 추가합니다.
  5. 프로브 정화를위한 Sephadex G50 컬럼을 준비합니다. 이를 위해, 열 50 μl 차단 버퍼를 추가하고 1,000 rpm으로 10 초을 위해 스핀.
    열 (즉, 그 결과 해당 컬럼에 적용되는 전체 50 μl가 원심 분리의 사이클 이후에 회복된다) 평형이 단계에게 2-3 번 반복합니다.
  6. Sephadex G50 칼럼, 위치 칼럼의 하단에 새로운 microfuge 튜브에 프로브 솔루션을 적용하고, riboprobe 솔루션의 정화 50 μl를 얻기 위해 1,000 rpm으로 3 분을 위해 스핀.
  7. 중 표준 포름 알데히드 - 아가로 오스 겔 RNA, 또는 분광 광도계를 사용하여 레이블 riboprobe의 품질 및 수율을 평가합니다.

4. 포스트 - 고정, 아세틸화 및 하이브리드화

  1. -80 ° C의 냉장고에서 섹션을 제거하고 평형에 실내 온도에 대한 허용합니다. 그 후, 5 분 추위, 갓 만들어진 3 % paraformaldehyde 솔루션 섹션을 품어.
  2. 간략 P의 부분을 씻어hosphate 두 번 호수 (PBS)를 버퍼.
  3. 표준 알코올 시리즈 (70, 95, 및 100 %, 2 분마다)를 통해 섹션을 탈수하고, 그들이 공기 건조하게.
  4. 10 분 아세틸화 솔루션 섹션을 품어.
  5. 2X SSPE에 섹션 3 번 린스.
  6. 표준 알코올 시리즈 위에서 설명한을 통해 다시 한번 섹션을 탈수하고, 그들이 공기 건조 수 있습니다.
  7. 하이브 리다이 제이션 솔루션의 적절한 볼륨을 준비하고 솔루션 (프로브 농도 : 각 프로브 1 NG / μl)를 모두 riboprobes를 추가합니다. 하이브 리다이 제이션 솔루션의 총 부피는 (섹션당 하이브 리다이 제이션 용액 16 μl) hybridized 수 섹션의 개수에 따라 결정됩니다.
  8. 그 공기 방울 오버레이에게 조직을 보장하지 조직 및 coverslip 슬라이드에 하이브 리다이 제이션 솔루션의 적절한 볼륨을 적용합니다.
  9. 이곳은 금속 슬라이드 홀더에 슬라이드. 미네랄 오일 욕조에 담가 소유자 ° C 야간 65으로 설정합니다. 그 coverslips (즉, 슬라이드 소유자의 측면은 미네랄 오일 컨테이너의 하단에 접촉해야합니다) 위쪽으로 직면하고 있는지 확인합니다.

5. 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다

  1. 다음날, 조심스럽게 미네랄 오일 목욕에서 슬라이드 홀더를 제거하고 간단히 슬라이드에서 여분의 기름을 제거하기 위해 클로로포름에 린스.
  2. 플레이스 5-10 분 2X SSPE 솔루션 슬라이드. Coverslips은 용액 중에 슬라이드에서 분리해야합니다.
  3. 새로운 2X SSPE 솔루션에 슬라이드를 전송하고, 실온에서 1 시간 그들을 유지.
  4. 2X SSPE 플러스 50 %의 포름 아미드를 포함하는 솔루션으로 섹션을 전송합니다. 이 솔루션의 온도는 야간 하이브 리다이 제이션 절차에 사용되는 온도를 일치해야합니다. 1.5 시간이 용액에 슬라이드를 유지.
  5. 0.1X SSPE 솔루션 하이브리드화 단계의 동일한 온도로 미리 예열 섹션을 전송합니다. 30 분이 솔루션 섹션을 품어. 추가 30 분에 대해이 단계를 반복합니다.

6. Riboprobes의 감지 및 시각화

  1. 어느하기 위해 0.3 % 과산화수소가 10 분 동안 추가되었습니다 TNT 버퍼에 슬라이드를 전송합니다.
  2. TNT 버퍼, 3 회 (각 10 분)에 섹션을 씻으십시오.
  3. DAKO 펜 사용하여 두뇌 섹션을 포함하는 주변 잘 그려. 중요한주의는 해당 섹션 건조하지 않도록하기 위해 행사되어야합니다.
  4. 각 슬라이드에 TNB 버퍼 150 μl를 적용하고, 습기 챔버에서 30 분이 솔루션 섹션을 품어.
  5. 틸팅 슬라이드로 초과 TNB 솔루션을 제거합니다.
  6. 2 시간의 습기가 실내에 퍼옥시데이즈 - 복합 백신 발굴 항체 및 저장 슬라이드가 포함된 TNB 솔루션 150 μl을 적용합니다. 항체 농도 전에 dFISH을 수행하기 위해 관심의 각 사본에 대해 개별적으로 결정되어야합니다.
  7. TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각.
  8. 알렉사 각 슬라이드 594 - 복합 tyramide 작업 솔루션을 150 μl를 적용하고, 1 시간에 습기 챔버에 저장합니다. 이 솔루션은 제조 업체의 지시에 따라 준비되어야합니다.
  9. TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각.
  10. 30 분 - TNT 버퍼에 품어 섹션 어느 위해 0.3 % 과산화수소 10에 추가되었습니다.
  11. TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각.
  12. 슬라이드 당 TNB 버퍼 150 μl를 적용하고, 30 분 습한 실내에 보관하십시오.
  13. 틸팅 슬라이드로 초과 TNB 솔루션을 제거합니다.
  14. 2 시간의 습기가 실내에 퍼옥시데이즈 - 복합 안티 - 비오틴 항체 및 저장 슬라이드가 포함된 TNB 솔루션 150 μl를 추가합니다.
  15. TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각.
  16. 알렉사 150 μl 488 - 복합 슬라이드 1 시간을 위해 품어 섹션 tyramide 작업 솔루션을 적용합니다. 이 솔루션은 제조 업체의 권고에 따라 준비되어야합니다.
  17. TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각.
  18. 섹션 Hoechst 솔루션 (TNT 버퍼에 1:1000) 150 μl를 추가 2 분 습한 챔버에 보관하십시오.
  19. TNT 버퍼에 섹션을 씻어, 3 회, 5 분마다.
  20. 형광 호환 설치 매체 (예 : Vectashield 또는 antifade을 연장)와 Coverslip 섹션.

7. 대표 결과

그림 1
그림 1. 우리는 여기 얼룩말 핀치 두뇌에서 얻은 대표 dFISH 결과를 보여줍니다. caudomedial nidopallium (NCM), 포유류의 청각 피질의 송버드 아날로그에서 얻은 photomicrographs 있습니다 표시됩니다. 뇌 섹션은 parvalbumin (A), 억제 신경의 하위 인구 마커에 대한 감독 biotinylated riboprobe와 hybridized 및 ribo 파고 - 라벨이 붙지만탐사선이 활동에 의존 유전자 zenk (B), 노래 위주의 뉴런에 안정적인 마커에 대한 감독. (A)와 (B) 청각 경험에 의해 활성화됩니다 억제 뉴런의 인구를 보여줍니다의 C) 중첩. 화살표와 화살촉이 두 riboprobes의 각 독점적으로 표시된 셀을 표시하고, 별표 관심의 두 사본을 공동 표현 대표 뉴런을 보여줍니다. 스케일 바 = 25 μm의.

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Discussion

우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally - 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수있을 것으로 예상했습니다. 신뢰할 수있는 결과와 최적의 신호를 취득하는 데 필요한 키 컨트롤의 그룹을 다른 11, 12에 의해 광범위하게 자세한되었습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

NIH / NIDCD 및 RP에 슈미트 재단의 보조금에 의해 지원 작동합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DEPC VWR international IC15090225 toxic substance
PCR purification kit Qiagen 28104
Formaldehyde VWR international BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase Roche Group 10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) VWR international IC816124
MgCl2 (1 M) Sigma-Aldrich 449172
Spermidine (1 M) Sigma-Aldrich S0266
DIG RNA labeling mix Roche Group NC9380805
Biotin RNA labeling mix Roche Group NC9440104
RNasin Promega Corp. N2111
BSA Sigma-Aldrich 05491
DTT Sigma-Aldrich D5545
Sephadex G50 VWR international 95016-772
EDTA VWR international 101384-758
SDS Sigma-Aldrich L4390
Transfer (t)RNA Invitrogen 15401011
10X MOPS VWR international 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde VWR international AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S3264
NaOH VWR international SX0600-1
Triethanolamine VWR international IC15216391
Acetic anhydride VWR international MK242002 toxic substance
SSPE VWR international 82021-488
Formamide VWR international JT4028-1 toxic substance
Poly A Invitrogen POLYA.GF
Mineral oil VWR international IC15169491
Chloroform VWR international BDH1109 organic solvent
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide VWR international VW36901 toxic substance
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Triton X-100 JT Baker X198-05
Anti-DIG HRP Roche Group 11093274910
Anti-biotin peroxidase Vector Laboratories SP3010
TSA Alexa Fluor 594 Invitrogen T20935
TSA Alexa Fluor 488 Invitrogen T20932
H–chst VWR international 200025-538
Vectashield Vector Laboratories H-1000
embedding mold VWR international 15160-157
cryostat Leica Microsystems CM 1850
Superfrost plus slide VWR international 89033-052

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

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References

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