Intravital Mikroskopi av Mouse Brain Mikrocirkulationen hjälp av ett slutet Kraniell fönster

Published 11/18/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Intravital mikroskopi för att följa tid och rum hemodynamiska och inflammatoriska händelser i pial mikrocirkulationen.

Cite this Article

Copy Citation

Cabrales, P., Carvalho, L. J. Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window. J. Vis. Exp. (45), e2184, doi:10.3791/2184 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denna experimentella modellen var utformad för att utvärdera musen pial mikrocirkulationen under akut och kronisk, fysiologiska och patofysiologiska hemodynamisk, inflammatoriska och metabola förhållanden, med hjälp av in vivo fluorescensmikroskopi. En stängd kraniell fönster placeras över vänster parieto-occipital cortex av möss. Lokala mikrocirkulation registreras i realtid genom fönstret med hjälp av EPI och fluorescens belysning, och mätningar av fartyg diameter och röda blodkroppar (RBC) hastigheter utförs. RBC hastighet mäts med hjälp av realtids korskorrelation och / eller fluorescerande-märkta erytrocyter. Leukocyter och trombocyter anslutning till pial fartyg och utvärdering av perfusion och vaskulärt läckage görs med hjälp av fluorescens-märkta markörer som albumin-FITC och anti-CD45-TxR antikroppar. Mikrocirkulation kan vara flera gånger video-inspelade under flera dagar. Vi använde för första gången den nära fönstret hjärnan intravital mikroskopi för att studera pial mikrocirkulationen att följa dynamiska förändringar under loppet av Plasmodium berghei ANKA infektion hos möss och visar att uttrycket av CM förknippas med mikrocirkulationen dysfunktioner kännetecknas av vasokonstriktion, kraftig minskning i blodet flöde och så småningom vaskulär kollaps.

Protocol

1. Kraniotomi

En kraniotomi i 8-till-10-veckor gamla möss måste utföras i förväg som tidigare beskrivits 1, förutom att en titan bar inte är placerad i huvudet av djuret. Den kroniska kraniala fönstret är en stabil beredning tillåter granskning av pial mikrocirkulationen och med månader efter att implanteras. Vanligtvis utför vi våra studier 2-3 veckor efter den kraniala fönstret implantation.

2. Intravital mikroskopi

  1. Två-tre veckor efter kraniotomi är kroppstemperaturen kontrolleras och då musen är lätt sövda med isofluran (4% för induktion, 1-2% för underhåll). Lätt anestesi används för att förhindra djur stress och obehag under den experimentella proceduren.
  2. Djuren placeras sedan i liggande position på en stereotaxic ram och huvudet försiktigt säkras med hjälp av örat barer. Nivån justeras med hjälp av höger och vänster handtag. Kroppstemperaturen hålls med hjälp av en värmedyna. Eftersom möss med cerebral malaria utveckla hypotermi, temperaturen inställningar behöver justeras för varje djur.
  3. Locket halka på kraniala fönstret är försiktigt rengöras med en bomullspinne fuktad med mineralolja och en panoramabild av fartyg under fönstret tas med hjälp av ett stereomikroskop och en digitalkamera (Nikon Coolpix 995, Japan). Bilden är tryckt, identifieras och daterad och kommer att användas som en karta för mätning av fartygets diameter och röda blodkroppar (RBC) hastigheter.
  4. Musen överförs sedan till en intravital mikroskop skede (anpassade Leica-McBain, San Diego, CA). En droppe vatten läggs på kraniella fönstret dra nytta av de bildade väl av dentala akryl, är fokus justeras. Mätningarna utförs med en 20X (LUMPFL-WIR, numerisk bländare 0,6, Olympus) objektiv nedsänkning i vatten. Samma fartyg följs så att direkta jämförelser till basnivåer kunde utföras möjliggör mer robust statistik för litet urval populationer. Bilderna har tagits med en digital svagt ljus höghastighetskamera (Hamamatsu C9300-221, Japan), eller svagt ljus analog kamera (COHU 4815, San Diego, CA) är ansluten till en videobandspelare band (JVC, Japan), klockslag (MicroImage Video Systems, Boyertown, PA) och en färgskärm (Pelco, Clovis, CA). Bandet är korrekt identifierade innan inspelningen startar, och tidsstämpel en identifiering av händelser genom att dokumentera den tid under vilken sådana händelser var kodas.
  5. En första kontroll av fartygen görs för att utvärdera kvaliteten av preparatet och om blodet flödar i alla fartyg. Då är valet av fartygen som ska mätas göras och den bör innehålla venoler och arterioler med olika diameter (i vårt mus pial förberedelser, de flesta fartyg på mellan 20 och 80μm) och täcker olika platser inom det område som exponeras vid fönstret. Arterioler och venoler lätt kan differentieras genom att kontrollera riktningen av blodflödet i förgreningar av fartyget (oavsett om det sprider eller samlar in blod). I våra studier är gjorda på 12 fartyg. Exakta läget för varje plats som ska mätas är kommenterade i bilden av pial kärlbädden.
  6. För varje plats, är fartyget diametern mäts med en anordning bild skjuvning (Bild Shear, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. När platsen är vald, är bilden av fartyget anpassas i vertikalt läge och bilden är klippt tills motsats ytterligheter är i linje och läsningen är dokumenterad. Detta värde kan omsättas i mikrometer av tidigare kalibrering för varje specifik förstoring med hjälp av ett hårkors Mikrometer kalibrering Stage (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ).
  7. Varje plats är inspelad under minst 30 sekunder för erytrocyt spårning. För spårning, är ett blodprov som samlats in och erytrocyter fluorescerande med carbocyanine dye Dil (molekylära sonder, Carlsbad, CA) och infunderas via svansvenen att få en in vivo-koncentrationen av ~ 0,4-0,5% 3. Hos djur infekterade med Plasmodium berghei ANKA (PBL) som uttrycker det grönt fluorescerande protein (PBA-GFP, en donation från Malaria Research och Reference Reagent resurscenter MR4, Manassas, VA, som deponerats av CJ Janse och AP-vatten), inga infusion av märkta cellen är nödvändig. De videobilder spelas in med 150 bilder per sekund. Denna kurs är inställd på att skaffa ett till sex bilder i en cell i en videobild för bestämning av hastigheter upp till 8 mm / s. Videon bilder digitaliseras med en personlig dator med Adobe Premier 4,0 mjukvara, och XY-koordinerade data för varje cell bild erhålls med hjälp av SigmaScan Pro 4,0 programvara (SPSS Chicago, IL) 4. Cell Positionerna bestäms manuellt i stället för bildanalys, med tanke på att ögat av en utbildad observatör har visat sig ge en bra uppskattning av var i mitten av en cell, somh i allmänhet motsvarar platsen för maximal fluorescens iakttas för de flesta celler riktlinjer. Flera bestämningar av position och hastighet görs för varje cell och i genomsnitt att få betyda RBC hastighet.
  8. När RBC hastighet mätningar utförs nu, överstiger den totala observationstiden för varje mus inte 10-15 minuter minimera cardiodepressive effekterna av anestesi.
  9. När fartyget diameter och RBC mätningar hastighet finns tillgängliga kan beräkningen av blodflödet i varje fartyg göras med hjälp av formel: Q = V x π (D / 2) 2, där Q = blodflödet, V = RBC hastighet och D = fartygets diameter.
  10. Dessa förfaranden kan upprepas över tid. Till exempel i den musmodell av cerebral malaria, utför vi dagliga mätningar start på dag 4 av infektion. De värden som erhållits varje dag för varje mus normaliseras i förhållande till dag 0 (pre-infektion), som anses vara 100%.
  11. Förutom fartyg diameter och blodvärden flöde, kan ytterligare bedömningar göras, till exempel bättre bedömning av perfusion och analys av leukocyt-och / eller trombocyter rullning och följsamhet i pial fartyg. Dessa mätningar utförs med hjälp av fluorescerande-märkta markörer. I fråga om malaria, kan vi upptäcka även cirkulerande eller anhängare parasiter genom att använda PBL stam som uttrycker GFP
  12. För perfusion bedömning använder vi en lösning av FITC-märkt albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), och att kvantifiera leukocyt följsamhet till pial fartyg vi använder antikroppar mot de pan-leukocyt markör CD45 märkta med Texas Red (TxR) ( Invitrogen, Karlsbad, Kalifornien 4μg/mouse). För detta 25μL av Albumin-FITC (2mg/mL) och 20μL av de anti-CD45-PE antikroppar (200μg/mL) blandat är och injiceras i förvärmda svansvenen. Musen kan sedan avbildas direkt, men om läckaget mätningar kommer att ta albumin-FITC tillåts cirkulera i 15 minuter. Grön fluorescens (518nm) som avges av albumin-FITC och GFP (PBA-GFP pRBC) fångas upp med hjälp och Alpha Vivid: XF100-2 (Omega Optisk, Brattleboro, VT), och anti-CD45-TxR fluorescens (615nm) är avslutat och fångade med en levande Standard: XF42.
  13. Den fluorescerande-märkta albumin ger förbättrad visualisering av vaskulära nätverket, inklusive penetrerande fartyg, och det är särskilt användbart i sjukdomstillstånd såsom cerebral malaria för att kontrollera icke-perfusion eller under-perfusion fartyg. Den kan också användas för att mäta vaskulärt läckage 5.
  14. Den fluorescerande-märkta anti-CD45 antikroppar gör det enkelt att identifiera och kvantifiera leukocyt rullande och vidhäftning till pial fartyg. För att undvika snedvridning i kvantifiering, kvantifiera vi rullning och vidhäftning på samma ställen fördefinierade för att mäta blodflödet. Kvantifiering av leukocyt vidhäftning görs genom att räkna antalet leukocyter i en 100μm-fartygets längd. Rolling kvantifieras genom att räkna antalet leukocyter färdas med en hastighet betydligt långsammare än blod hastighet i samma 100μm längd under 30 sekunder.

3. Representativa resultat

Figur 1
Figur 1. (Steg 2,6) Bilder på musen pial vaskulära nätverk tillgängliga via kraniella fönstret.

Figur 2
Figur 2. (Steg 3,1-3,5) Schematisk visning av inställd för intravital mikroskopi av musen pial mikrocirkulation. 1: intravital mikroskop, 2: 20X nedsänkning i vatten mål, 3: ljuskälla, 4a: digitala svagt ljus höghastighetskamera, 4b: analog kamera, 5: musen i stereotaxic ram, 6: datorskärm, 7: Analog Shearer bildskärm som visar hur bilden klippning (pilen) görs för att mäta fartygets diameter.

Figur 3
Figur 3. (Steg 3,6-3,8) Microvascular röda blodkroppar hastighet mätningar för cell tracking från hög hastighet fluorescens videoinspelningar. Bilder A till F är sekvens bilder av en pial fartyg, visar en enda röra RBC korsar mikroskopiska området avgränsas av kameran. Manuell bestämning av ruta för ruta positioner 15 eller flera celler som korsar området, med dess förkalibrerade avstånd, kan man beräkna menar RBC hastighet i varje fartyg med hjälp av ett Excel-ark.

Figur 4
Figur 4. (Steg 3,9) Uppgifter om en representant experiment som visar förändringar i pial blodflödet över tiden i Plasmodium berghei ANKA (PBL) infekterade möss (n = 5) och hos icke-infekterade kontroll möss (n = 5). I kontroll möss de pial blodflödet är relativt stabil över tiden, PBA-infekterade möss visar en markant minskning av blodflödetvid cerebral malaria utveckling (dag 6). Data är medelvärdet ± SEM.

Figur 5
Figur 5. (Steg 4,3) Ett stort antal leukocyter anhängare till pial fartyg från en mus infekterad med Plasmodium berghei Anka, som avslöjades genom färgning med anti-CD45-Texas Red fluorescerande antikroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den intravital mikroskopi metod som beskrivs här ger ett unikt och kraftfullt verktyg för detaljerad observation av pial mikrocirkulationen i musen. Det gör att peka ut enskilda arterioler och venoler och mäta förändringar av ett antal parametrar som fartyget diametrar, RBC hastigheter, blodflöde, följsamhet och rullande av leukocyter, trombocyter och andra element blod, vaskulärt läckage, vävnad pH och pO2 och potentiellt många andra applikationer. In vivo-vaskulära svar kan utredas omgående på insatser som läkemedelsverket eller vid patologiska processer. Dessutom kan mikrocirkulationen beteendet vara dynamiskt följas upp över tid. Vi har använt denna teknik för att studera pial mikrocirkulationen förändringar under cerebral malaria orsakad av P. berghei ANKA i musen, och har visat att neurologiska syndrom i den här modellen är förenad med en mikrocirkulationen dysfunktion kännetecknas av minskad cerebralt blodflöde, vasokonstriktion, nedsatt perfusion och så småningom vaskulär kollaps 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats med bidrag R01-HL87290, R01-HL87290-S1 och R01-AI082610 från National Institutes of Health till LJMC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Baxter Internationl Inc. FDG9623
Carbocyanine dye Dil Molecular Probes, Life Technologies D306
Albumin-FITC Sigma-Aldrich A9771
Anti-CD45-TxR Ab Invitrogen MCD4517
P. berghei ANKA-GFP MR4 MRA-865

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (15), (2008).
  2. Intaglietta, M., Tompkins, W. R. Microvascular measurements by video image shearing and splitting. Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).
  3. Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).
  4. Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).
  5. Baldwin, A. L. Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).
  6. Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine. Am. J. Pathol. 176, (3), 1306-1315 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats