شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذه الورقة توضح أساليب مختلفة من النمو

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد ارتبطت الأغشية الحيوية البكتيرية مع عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان المختلفة ، ولكن عموما كانت التنمية بيوفيلم درس على الأسطح غير الحية. في هذه الورقة ، ونحن تصف بروتوكولات لتشكيل الأغشية الزائفة الزنجارية على الخلايا الظهارية البشرية الهوائية (خلايا CFBE) نمت في الثقافة. في الأسلوب الأول (يطلق عليه نموذج ثابت بيوفيلم المشارك الثقافة) ، P. وحضنت الزنجارية مع الخلايا كما نمت CFBE monolayers متكدسة على مستوى لوحات زراعة الأنسجة. على الرغم من أن البكتيريا السامة جدا على الخلايا الظهارية ، وبالإضافة إلى ذلك التأخير أرجينين تدمير المونولاير طويلة بما يكفي لتشكيل الأغشية الحيوية على الخلايا CFBE. الأسلوب الثاني (وهو ما يسمى التدفق الخلوي بيوفيلم النموذجي المشارك الثقافة) ، ويشمل التكيف من خلية جهاز بيوفيلم التدفق ، والتي كثيرا ما تستخدم في البحوث بيوفيلم ، ساترة لاستيعاب الزجاج دعم أحادي الطبقة من الخلايا CFBE متموجة. هذا هو تحصين المونولاير مع P. الزنجارية ومضخة تمعجية تدفقات ثم متوسطة جديدة عبر الخلايا. في كلا النظامين ، الأغشية الحيوية البكتيرية شكل داخل 6-8 ساعات بعد الحقن. ومما يعزز التصور للبيوفيلم عن طريق استخدام P. سلالات الزنجارية constitutively معربا عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). وتدفق ثابت الخلية المقايسات بيوفيلم المشارك الثقافة هي نظم في وقت مبكر نموذجا للP. العدوى الزنجارية في الرئة الكيسي (CF) التليف ، وتسمح هذه التقنيات مختلف جوانب P. أن يكون درس الزنجارية تشكيل بيوفيلم والفوعة ، بما في ذلك السمسة بيوفيلم ، وقياس CFU بيوفيلم ، وتلطيخ والرؤية وبيوفيلم.

Protocol

1. ثابت النموذجي بيوفيلم المشارك الثقافة

  1. ثابت النموذجي بيوفيلم المشارك الثقافة CFBE41o 1 يستخدم خلايا (خلايا CFBE) ، والتي خلدت الخلايا وضعت أصلا من الفرد متماثل مع قوات التحالف لطفرة ΔF508 - CFTR 2،3،4. وينبغي أن خلايا المصنف CFBE في تركيز خلايا 6 10 / طبق بشكل جيد في نسيج الثقافة جيدا أو 6 - 2 X 10 5 في طبق نسيج الثقافة 24 بشكل جيد في الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، L - 2mm والجلوتامين ، 50 U / مل البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. نستخدم المتوسط ​​1.5 مل لكل بئر في لوحات 6 - جيدا و 0.5 مل لكل بئر المتوسطة في 24 لوحات جيدة.
  2. وينبغي أن نمت الخلايا عند 37 درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ -95 ٪ 2 الهواء لمدة 7-10 أيام لتشكيل المونولاير متموجة قبل التلقيح مع البكتيريا. يجب تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. وقد تبين أن هذه الظروف أن تؤدي إلى تشكيل المونولاير متكدسة ومنعطفات ضيقة.
  3. P. الزنجارية تنمو في LB 5 مل لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر حاضنة عند 200 دورة في الدقيقة. في ظل هذه الظروف ، P. وسوف تصل الثقافات الزنجارية عادة كثافة CFU 5x10 9 / مليلتر.
  4. التلقيح البكتيرى لإزالة الخلايا المتوسطة من CFBE وإضافة حجم مساو من دون MEM أحمر الفينول ، على أن تستكمل مع 2 مم L - الجلوتامين (وسط الميكروسكوب). يتم تلقيح monolayers CFBE متموجة مع P. الزنجارية في عدد وافر من إصابة ما يقرب من 30:1 النسبي لعدد من الخلايا CFBE المصنفة أصلا. وهذا يساوي 2 X 10 7 كفو / مل مل في MEM 1.5 / جيد لمدة 6 - جيدا لوحات و 1.2 X 10 7 كفو / مل مل في MEM 0.5 / جيد لوحات 24 أيضا.
  5. احتضان لوحات لمدة 1 ساعة إلى 37 درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ -95 ٪ الهواء 2.
  6. بعد حضانة 1 ساعة ، ينبغي إزالة طاف واستبدالها المتوسطة الميكروسكوب جديدة تستكمل مع أرجينين 0.4 ٪.
  7. احتضان ثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 درجة مئوية و 5 ٪ -95 ٪ 2 الهواء للحصول على نقاط زمنية مختلفة (تصل إلى 8 ساعات تقريبا) ، وتحليل سلامة المونولاير CFBE باستخدام المجهر مرحلة التباين. إذا خلايا المسالك الهوائية هي غير متموجة ، P. سوف الزنجارية بسرعة (في غضون دقائق) للوصول إلى السطح basolateral من الخلايا وتدمير سلامة الخلوية. التلقيح مع P. سلالات الزنجارية التي تعبر عن النتائج constitutively GFP في microcolonies بيوفيلم الفلورسنت التي يمكن تصور أو بواسطة المجهر epifluorescence مبائر.
  8. يمكن تحديد CFU البكتيرية في بيوفيلم التي شاركت في غسل ثقافة 2-3 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للقضاء على البكتيريا العوالق. بعد غسل ومعالجة بنسبة 0.1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني أو MEM لمدة 10-15 دقيقة لليز الخلايا الظهارية وتفريق بيوفيلم.
  9. دوامة لمدة 3 دقائق ، وإعداد التخفيفات التسلسلي للlysate. لوحة على هذه التخفيفات آغار LB واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. عدد المستعمرات في اليوم التالي لتحديد CFU.

2. تدفق خلية بيوفيلم النموذجي المشارك الثقافة

  1. التدفق النموذجي خلية بيوفيلم المشارك الثقافة (مقايسة التدفق) ينطوي على تعديل للجهاز بيوفيلم القياسية لاستيعاب تدفق الخلايا خلايا CFBE 5.
  2. وضع العديد من الزجاج قطرها 40 ملم coverslips الى 100 مل دورق نظيفة. غطاء محكم مع 2 طبقات من رقائق الألومنيوم والأوتوكلاف على دورة جافة لمدة 20 دقيقة.
  3. يعمل في خلية غطاء الثقافة وانتزاع واحدة ساترة العقيمة من الدورق باستخدام الملقط الايثانول غسلها والمكان الى العقيمة قطرها 60 ملم طبق من البلاستيك.
  4. أضف 3 مل من قبل خلية حرارة متوسطة النمو ، والضغط على ساترة مع غيض من ماصة لإزالة أي فقاعة محاصرين تحت وقوة ساترة إلى أسفل الطبق البلاستيك.
  5. البذور 2x10 6 خلايا في طبق وطبق يهز بلطف ذهابا وإيابا. تجنب دوامات لمنع الطرد المركزي الخلايا ضد جانبي الطبق.
  6. مكان الطبق في ثاني 5 ٪ -95 ٪ 2 في الهواء الحاضنة 37 درجة مئوية وتغذية الخلايا كل يوم مع 3 مل متوسطة النمو الطازجة لمدة 8 إلى 10 أيام. سيتم تشكيل خلايا المونولاير متكدسة على ساترة الزجاج.
  7. تنمو P. LB الزنجارية في 5 مل لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر حاضنة عند 200 دورة في الدقيقة. في ظل هذه الظروف ، P. وسوف تصل الثقافات الزنجارية عادة كثافة CFU 5x10 9 / مليلتر. نستخدم P. PAO1 سلالة الزنجارية تحمل البلازميد pSMC21 للتعبير التأسيسية للGFP 6.
  8. إضافة 1 مل من ثقافة البكتيرية في أنبوب microcentrifuge العقيمة. الطرد المركزي عند 6000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، ويغسل بيليه البكتيرية مرتين في 1 مل من المتوسط ​​الميكروسكوب.
  9. مخفف 0.5 مل من البكتيريا غسلها ومعلق في المتوسط ​​4.5 مل الميكروسكوب لتحقيق تركيز ~ CFU 5x10 8 / مليلتر.
  10. مراقبة الخلايا الحيةفي الوقت الحقيقي يتطلب وجود غرفة التصوير بالإضافة إلى مضخة تمعجية (لضمان تدفق المواد الغذائية لفترات طويلة من الزمن) ، وتحكم في درجة الحرارة. نستخدم FCS2 Bioptechs (Focht خلية حية) غرفة متصلة التدفق المنخفض الصغير مع مضخة نضح 16/01 خفض ال C - الأنابيب المرنة لأطوال مناسبة وتعقيمها للعقم ، ودرجة الحرارة التنظيم عبر وحدة تحكم FCS2 الغرفة. علينا أن نحافظ على مصدر الدخل المتوسط ​​في حمام مائي 37 ° C الموجود بجوار المجهر.
  11. غرفة تجميع التدفق. غرفة FCS2 يتضمن قاعدة تأمين الذاتي (الذي يجلس على خشبة المسرح خلال محول التصوير) ، والنصف العلوي للأنابيب توصيل وحدة تحكم نضح الغرفة. يتم تجميعها في الغرفة رأسا على عقب قبل أن انقلبت ووضعها على محول المرحلة. يعقد في النصف العلوي من الغرفة رأسا على عقب بحيث أن أنابيب أسفل نضح مرئية ، ومحاذاة الثقوب إزالة المطاط طوقا سميكة 0.75 ملم على أنابيب الارواء. مكدس الشريحة microaqueduct قدمت مع الغرفة على رأس طوقا المطاط ، والتأكد من الجانب مخدد متروك ، ومكان آخر طوقا المطاط على الجزء العلوي من الشريحة. وسمك والهندسة الداخلية لهذا طوقا second تحديد حجم الغرفة. نحن نعمل عادة مع طوقا 0.75 ملم مطاطية سميكة مع هندسة 30 ملم الداخلية المستديرة.
  12. إضافة 1 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) متوسط ​​الميكروسكوب في وسط الشريحة.
  13. استرداد طبق من عيار 60 ملم من الخلية الحاضنة والثقافة ، وإزالة المتوسطة المستهلك وغسل خلايا مرة واحدة مع 3 مل من المتوسط ​​الميكروسكوب قبل تحسنت. هذه الخطوة يضمن القضاء على أحمر الفينول والمضادات الحيوية موجودة في خلية متوسطة النمو. أحمر الفينول هو أقل ما يقال الفلورسنت ويمكن أن تتداخل مع التصوير ، في حين أن المضادات الحيوية يمكن القضاء على P. الزنجارية البكتيريا قبل أن يتمكنوا من إقامة الأغشية الحيوية.
  14. استخدام الايثانول غسلها الملقط ، استرداد ساترة من الطبق والدنيا رأسا على عقب على حبة متوسطة مجهرية وضعت على الغرفة. ساترة ليستريح الآن على المطاط طوقا الثانية وأحادي الطبقة من الخلايا الهوائية باتجاه الأسفل.
  15. عقد مكونات تجميعها في يد واحدة ، وضع قاعدة للغرفة على أعلى المكدس ، وتحويل أكثر من الغرفة بسرعة بحيث ان كل شيء الجانب الأيمن الأعلى. تأمين قاعدة في مكانه من خلال تحويل الحلبة.
  16. توصيل أنبوب مدخل إلى انخفاض تدفق الجزئي مضخة نضح وبدء تدفق بمعدل 20 مل / ساعة ، وهذا هو معدل التدفق في السباحة القدرة سرعة P. الزنجارية. قطعة ثانية من وصلات أنابيب ضخ لقارورة متوسطة الميكروسكوب وضعها في حمام مائي 37 ° C الموجود بجوار المجهر.
  17. نعلق معقمة قبل قطع 16/01 ال C - فليكس الأنابيب إلى مدخل ومخرج أنابيب نضح من الغرفة ، الاتصال وحدة تحكم في درجة الحرارة ، ثم ضع دائرة تجميعها على خشبة المسرح مجهر مجهر an مضان مقلوب.
  18. استخدام حقنة 1 مل القابل للتصرف ، وضخ تعليق معدة مسبقا البكتيرية الى غرفة ، وذلك باستخدام صمام اتجاهين وضعت في خط بين المضخة وحجرة. لدينا في وضع معين ، فإنه يأخذ حجم 0.6 مل من تعليق البكتيرية للوصول الى الغرفة. ضبط هذه الكمية وفقا لطول الأنبوب الخاص معين. نجد أيضا أنه من المفيد لوضع القابل للتصرف في خط 0.22 ميكرون تصفية بين المضخة وصمام ثنائي الاتجاه لمنع البكتيريا من السباحة المنبع وتلويث القارورة الإدخال.
  19. لتسمح للبكتيريا ليلتصق بالخلايا الهوائية ، ووقف ضخ ل2H. يمكن أن يكون تدفق ثم استأذن وحافظت على 20 مل / ساعة لبقية التجربة.
  20. مراقبة سلامة الخلايا الهوائية على النقيض من ذلك التدخل التفاضلية (DIC) المجهري في كافة مراحل التجربة للتحقق من علامات الأضرار التي لحقت أحادي الطبقة. في نفس الوقت ، متابعة تطور GFP المسمى P. الأغشية الحيوية الزنجارية على سطح الخلايا قمية الهوائية من خلال الحصول على الصور مع مجهر مقلوب مضان مبائر أو واسعة في الميدان.

3. ممثل النتائج

نستخدم سلالة P. الزنجارية التي تحتوي على البلازميد pSMC21 الذي يسمح للتعبير التأسيسية للGFP 6. لهذا السبب ، لا يمكن GFP الأغشية الحيوية التي تحمل علامات متزايدة على أن تصور أحادي الطبقة CFBE بواسطة المجهر epifluorescence. بدلا من ذلك ، لا يمكن تحقيق التصور للبيوفيلم التي تلطيخ P. غير المسماة الزنجارية بمحلول 1 ٪ من البيض calcofluor لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية 1.

لتشكيل بيوفيلم التصوير على الخلايا CFBE في مقايسة التدفق ، ونحن نستخدم محول المرحلة مصنوعة خصيصا ، ولكن العديد من الشركات يمكن أن توفر الآن مرحلة تركيب محولات خاصة. ونحن نعمل مع مجهر مقلوب IX70 أوليمبوس مجهزة ORCA - AG العميق كاميرا CCD التبريد وx60 النفط الغمر الهدف (الفتحة العددية 1.40). مرشح ثوقد تم تجهيز كعب مع فرقة نانومتر 480/40 تصفية الإثارة وتمرير شريط تمرير تصفية نانومتر 535/30 الانبعاثات. تم الحصول على الصور الرقمية مع برنامج حزمة OpenLab 4.0.3 (الارتجال) ، وكانت deconvolved مجلدات تكرارية استعادة باستخدام Volocity 3.5.1 البرمجيات (الارتجال). وقد تحقق التحليل الكمي للهياكل بيوفيلم 3D مع حزمة برامج تحليل الصور COMSTAT 7،8.

أي نموذج لثقافة المشاركة في النظر فيها ، لا بد من إيلاء اهتمام خاص لتطوير السمسة بين مكونات هذا النموذج. ثابت في كل خلية والمقايسات التدفق ، وجدنا أن المونولاير CFBE يمكنها ان تتحمل وجود P. الزنجارية لمدة تصل إلى 8 ساعات بعد التلقيح من دون أي علامة على التغيير. ويمكن تقييم سلامة أحادي الطبقة الظهارية التي على النقيض من المرحلة المجهري باستخدام مجهر مقلوب 1 (الشكل 1A) أو عن طريق التدخل التفاضلية المجهري (DIC) المقابل في كافة مراحل التجربة 5. بمرور الوقت ، P. وسوف تنتج السموم الزنجارية عوامل الفوعة والتي تتراكم ويمكن أن تتلف الخلايا الظهارية المونولاير بالكامل أو في الفروع (الشكل 1B - 1C). يمكن السمسة المقررة كميا باستخدام مجموعات مختلفة لقياس الافراج عن اكتات نازعة (LDH) من الخلايا الظهارية. هو إنزيم LDH مستقرة عصاري خلوي صدر في الوسط خارج الخلية عند تحلل الخلية أو موت الخلية.

عندما لا خطر على سلامة أحادي الطبقة الهوائية (عادة لتلقيح ~ ح 8 التالية) ، P. يمكن الزنجارية الأغشية الحيوية وتطوير النموذج بنجاح على سطح الخلايا الهوائية القمي في نماذج المشاركة في الثقافة على حد سواء ووصف (الشكل 2A - 2B). بعد إعادة الإعمار 3D (الشكل 2C) والكمي ، ويمكن تحديدها بدقة تراكم الكتلة الحيوية. وقد استخدمنا أيضا هذه الأغشية الحيوية المشترك الثقافة في عدة فحوصات المظهري. على سبيل المثال ، على النحو المذكور أعلاه ، يمكن بسهولة تحديد بيوفيلم CFU lysing بواسطة الخلايا الظهارية ، وتمييع lysate متسلسل ، والطلاء على لوحات أجار. لقد تم العثور على هذه التقنية مفيدة في تحديد مقاومة سلالات مختلفة للعلاج بالمضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك ، يمكن قياس بيوفيلم سمية تجاه باستخدام الخلايا الظهارية المتاحة تجاريا مجموعات الكشف LDH. بهذه الطريقة ، يمكن تقييم دور العوامل في الفوعة سمية الأغشية الحيوية. هذه النظم دعم موديل أيضا عددا من التطبيقات التعبير الجيني ، بما في ذلك دراسات الانصهار المروج ، RT PCR ، وتحليل [ميكروأري 1،5،9.

الشكل 1
الشكل 1. أحادي الطبقة من الخلايا CFBE وصور ممثل للخطر وإلحاق أضرار monolayers الخلية الهوائية بسبب P. الزنجارية بيوفيلم النمو : (أ) صورة الممثل من المونولاير متموجة من الخلايا التي تزرع في لوحات CFBE زراعة الأنسجة ، والمقررة على النقيض من المرحلة المجهري. مقياس شريط ، و 120 ميكرومتر. (ب) مثال على المونولاير CFBE خطر. على الرغم من أن لا يعرض المونولاير علامات مرئية واضحة من الضرر حتى الآن ، P. وتعتبر البكتيريا الزنجارية ينتشر بين منعطفات ضيقة من الخلايا الظهارية والتمكن من الحصول على الأغشية basolateral. عادة تشكيل بيوفيلم لم يتحقق في ظل هذه الظروف نظرا لتدهور أحادي الطبقة. مقياس بار ، و 20 ميكرومتر. (C) مثال لP. متضخمة ولاحظ بيوفيلم الزنجارية 24 ساعة بعد التطعيم. بعد دعم بنجاح تشكيل بيوفيلم ، ألحقت أضرار لا يمكن إصلاحها المونولاير CFBE والآن تكاد تكون معدومة. ويرد بيوفيلم المتبقية ، وتزايد كطبقة مسطحة من البكتيريا ، والمترتبة على ساترة الزجاج. مقياس بار ، و 20 ميكرومتر.

الشكل 2
الشكل 2. P. الأغشية الحيوية الزنجارية نمت على سطح الخلايا قمية CFBE متموجة باستخدام نموذج ثابت بيوفيلم المشارك الثقافة وتدفق النموذجي خلية بيوفيلم المشارك الثقافة (A) صورة الممثل من الإعراب ، P. GFP بيوفيلم الزنجارية نمت على أحادي الطبقة من الخلايا متموجة CFBE باستخدام نموذج ثابت بيوفيلم المشارك الثقافة ، والمقررة من قبل epifluorescence المجهري. الصورة تراكب المرحلة القناة وعلى النقيض من قناة مضان. مقياس بار ، و 35 ميكرومتر. (ب) صورة من الممثل المسمى ب GFP بيوفيلم الزنجارية نمت لمدة 6 ساعات على أحادي الطبقة من الخلايا متموجة CFBE باستخدام نموذج تدفق خلية بيوفيلم المشارك الثقافة. لتسهيل تصور من أحادي الطبقة الهوائية ، وكانت ملطخة النوى مع 10 ميكروغرام / مل هويشت 33342 (المسابر الجزيئية) لمدة 30 دقيقة قبل التلقيح مع P. الزنجارية. واعتبرت الصور المدمجة وعلى النقيض من ذلك التدخل pseudocolored التفاضلية (DIC) ، وتظهر الصور المقابلة الفلورسنت. وفرقت الأغشية الحيوية ، كما عرض كتل خضراء تعلق على سطح الخلايا قمية CFBE ، عبر الخلايا الهوائية. مقياس بار ، و 20 ميكرومتر. (ج) ثلاثة الابعاد reconstrucنشوئها من مداخن صورة Z - سلسلة تبين الفطر نموذجية مثل هياكل P. ح البالغ من العمر 6 الأغشية الحيوية على تشكيل الزنجارية المونولاير CFBE الخلية. مقياس بار ، و 10 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأغشية الحيوية هي مجتمعات من البكتيريا التي تشكل استجابة للمؤثرات البيئية. هذه الاشارات البيئية تؤدي إلى تغييرات تنظيمية عالمية ضمن كل بكتيريا ، مما أدى إلى الربط إلى السطح ، والتجميع ، وإنتاج exopolysaccharides ، والظواهر الأخرى مثل زيادة مقاومة المضادات الحيوية 10. على مدى العقدين الماضيين ، وقد دعمت الكثير من الأدلة على فرضية أن الأغشية الحيوية تلعب دورا كبيرا في التسبب في العدوى المزمنة. على سبيل المثال ، يتم قبول جيدا أن P. الزنجارية هي قادرة على إقامة التهابات مزمنة في الرئتين من مرضى التليف الكيسي (CF) التليف عن طريق تشكيل الأغشية الحيوية 11. CF هو اضطراب وراثي ، حيث طفرات في الجين CFTR يؤدي إلى إفراز كلوريد غير لائق 12. مرضى التليف الكيسي تجربة غيرت مجرى الهواء عادة مما يؤدي إلى الفيزيولوجيا المقابس مخاط سميك في الشعب الهوائية ، وبشكل متزامن ، إلى العدوى الميكروبية 13. قبل مرحلة المراهقة المتأخرة ، وكيل شركة الخطوط الجوية السائدة المعدية CF هو P. الزنجارية ، مما أدى إلى إصابة بيوفيلم المزمنة التي تقاوم المضادات الحيوية 14.

وقد تم تطوير البروتوكولات وصفها في هذه الورقة لتكون بمثابة نموذج لدراسة نظم تشكيل بيوفيلم على خلايا الرئة الحية. وتورط الأغشية الحيوية الجرثومية في دول كثيرة ، والمرض ، ومع ذلك ، فقد درست في معظمها غير الحية الأسطح الصلبة مثل الزجاج والبلاستيك 15،16. من خلال دراسة تشكيل بيوفيلم والنمو على الأسطح اللاأحيائية فقط ، واحد مفقود تفاعلات مهمة بين الممرضة والمضيفة التي يمكن أن تحدث فقط مع النظام النموذجي كما هو موضح في هذه البروتوكولات المذكورة أعلاه. تحديدا ، ثابت النموذجي بيوفيلم المشارك الثقافة وتدفق النموذجي خلية بيوفيلم المشارك الثقافة الاستفادة من قدرة P. الزنجارية للتفاعل مع وربط سطح الظهارية في الرئة. باستخدام هذه النماذج ، وأظهرنا أن الاستجابة للثقافة تشارك في الأغشية الحيوية للعلاج بالمضادات الحيوية التي هي فريدة من نوعها وهذه النماذج هي أكثر عرضة للدولة تعكس بدقة 1،5 المعدية. في هذا الصدد ، وقد أبلغنا بأن المقاومة للزيادات التي توبراميسين> 25 أضعاف عند P. وتزرع في خلايا الأغشية الحيوية الزنجارية الهوائية مقارنة الأغشية الحيوية نمت على السطوح اللاأحيائية مثل الزجاج 5. فمن المرجح أن تعكس هذه التقنيات الأحداث التي تحدث أثناء الاستعمار في وقت مبكر من 17 الرئة. لذلك ، نظم نموذج التعاون ثقافة تمثل أدوات مبتكرة لفهم العدوى في وقت مبكر من ظهارة الهوائية CF بواسطة P. الزنجارية 1.

وقد تم عموما نظم زراعة الأنسجة المستخدمة لفهم التفاعلات بين المضيف والممرض. اتخذنا هذه التفاعلات خطوة أخرى على طريق تشكيل الأغشية الحيوية الخلايا الحية الظهارية البشرية. في المستقبل ، وصفت نسخ معدلة من النماذج هنا يمكن استخدامها للتحقيق في تشكيل بيوفيلم مختلفة من البكتيريا المعدية في الدول الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر G. O تول عن التوجيه والاقتراحات في تطوير هذه النماذج. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة التليف الكيسي (ANDERS06F0 لGGA ، وSTANTO07RO STANTO08GA لوبا) ، والمعاهد الوطنية للصحة (T32A107363 لGGA وR01 - HL074175 لوبا) ، والمركز الوطني لبحوث الموارد مراكز البحوث الطبية الحيوية للتميز (كوبر P20 - RR018787 لوبا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber Bioptechs 060319131616
FCS2 chamber controller Bioptechs 060319-2-0303
40 mm glass coverslips Bioptechs PH 40-1313-0319
MEM Mediatech, Inc. #10-010-CV
MEM without phenol red Mediatech, Inc. Mediatech, Manassass, VA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
  2. Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
  3. Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
  4. Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
  5. Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
  6. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
  7. Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146, (Pt 10), 2409-2415 (2000).
  8. Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  9. Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
  10. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  11. Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
  12. Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
  13. Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
  14. Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
  16. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  17. Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).

Comments

4 Comments

  1. HI thanks for this video it was really great. I was wondering if you have tried using A549 cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 12:28 PM
  2. Not to my knowledge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 5:27 PM
  3. Can this system be used to study effect of various antibiotics on P.
    aeruginosa biofilm formation

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2011 - 11:14 PM
  4. Yes, and we have done so (see references #1 and #5 of the protocol).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 8, 2011 - 1:42 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics