共培养模型绿脓杆菌现场人类呼吸道细胞生长的生物膜

Immunology and Infection

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Summary

本文介绍了成长的不同方法

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Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

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Abstract

细菌生物膜与多种人类疾病的数量,但生物膜的发展已普遍在非生物表面研究。在本文中,我们描述了人类呼吸道上皮细胞培养(CFBE细胞)形成铜绿假单胞菌生物膜的协议。在第一种方法(称为静态共培养生物膜模型),P.绿脓杆菌是与标准组织培养板汇合单层生长的CFBE细胞培养。虽然细菌是上皮细胞的毒性,除了单层的破坏精氨酸延误时间足够长的生物膜形成上的CFBE细胞。第二种方法(称为流细胞共培养生物膜模型),涉及适应生物膜的流动池装置,这是在生物膜研究中,经常使用,以适应支持CFBE细胞融合单层玻璃盖玻片。这是接种单层与体育假单胞菌和蠕动泵,然后流经细胞的新鲜培养基。在两个系统中,细菌生物膜的形成,接种后6-8小时内。生物膜的可视化是提高使用 P. 假单胞菌菌株表达绿色荧光蛋白(GFP)。静态和流动细胞共培养生物膜检测早期体育的模型系统绿脓杆菌感染的囊性纤维化(CF)的肺,这些技术允许不同方面的P.假单胞菌生物膜的形成和毒性研究,包括生物膜的细胞毒作用,生物膜CFU测量,染色和可视化生物膜。

Protocol

1。静态共培养生物膜模型

  1. 静态共培养生物膜模型1使用CFBE41o细胞(CFBE细胞),这是永生细胞最初是从个人发展与ΔF508- CFTR的突变 2,3,4 CF合子。 CFBE细胞应接种/ 6孔组织培养板在24孔组织培养板在最短的基本培养基辅以10%胎牛血清(MEM)或2 × 10 5 10 6个细胞的浓度, 2mm的L -谷氨酰胺,50 U / mL青霉素,50μg/ mL链霉素。我们使用1.5毫升培养基,每孔6孔板和24孔板,每孔0.5 mL于中等。
  2. 细胞增长应在37 ° C和5%CO 2 -95%为7-10天的空气,形成与细菌接种前的汇合单层。介质必须每2-3天。这些条件已被证明导致形成一个融合的单层和紧密连接。
  3. 绿脓杆菌增长在5毫升LB培养基,18小时在37 ° C在200转的孵化器振动筛。在这些条件下, 体育假单胞菌的文化通常会达到5X10 9 CFU / mL的密度。
  4. 细菌接种,CFBE细胞中删除,添加等体积的无酚红的MEM,辅以2毫米L -谷氨酰胺(显微镜中等)。聚合CFBE单层接种与体育假单胞菌的感染多重约30:1相对于原来种子CFBE细胞的数量。这相当于2 × 10 7 CFU / ml为1.5毫升的MEM / 6孔板和1.2 × 10 7 CFU / ml的0.5毫升的MEM / 24孔板。
  5. 孵育1小时板块在37 ° C和5%CO 2 -95%的空气。
  6. 1小时的潜伏期后,应删除上清,而代之以新鲜显微镜0.4%,精氨酸培养基。
  7. 在37 ° C和5%CO 2 -95%的空气和分析不同时间点(约8小时)CFBE使用相衬显微镜的单层的完整性。如果气道细胞非融合,P。假单胞菌在几分钟之内将迅速获得基底细胞表面,破坏细胞的完整性。接种与体育假单胞菌株,组成性表达GFP的荧光生物膜microcolonies可epifluorescence或共聚焦显微镜观察的结果。
  8. 可以由共培养与磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2-3次,以消除浮游细菌生物膜中的细菌菌落形成单位。洗净后,用0.1%Triton在PBS或MEM X - 100的10-15分钟的裂解上皮细胞和分散的生物膜。
  9. 涡3分钟,并准备系列稀释裂解液。这些稀释到LB琼脂板孵育过夜,于37 ° C。第二天的菌落计数来确定的CFU。

2。流动细胞共培养生物膜模型

  1. 流动细胞共培养生物膜模型(流量分析)涉及标准生物膜流动单元设备的修改,以适应CFBE 细胞 5 。
  2. 几个直径为40毫米的盖玻片放入一个干净的100 mL烧杯。紧盖2层铝箔和高压灭菌干燥周期为20分钟。
  3. 在细胞培养罩工作,抢一个使用乙醇洗涤钳和地点到无菌的60毫米直径的塑料盘的烧杯中无菌盖玻片。
  4. 预热细胞生长的培养基中加入3毫升,按吸管尖盖玻片上删除被困于车底的泡沫,迫使盖玻片的塑料盘底部。
  5. 种子2X10 6细胞每道菜和动摇的菜来回轻轻。避免纷飞,以防止离心对双方的菜细胞。
  6. 放置在5%的CO 2 -95%空气培养箱在37 ° C的菜,饲料用3 mL新鲜生长培养基为8至10天的细胞,隔日。这些细胞会形成融合单层玻璃盖玻片上。
  7. 拓展体育假单胞菌在5毫升LB培养基,18小时在37 °的C(孵化器振动筛在200转)。在这些条件下, 体育假单胞菌的文化通常会达到5X10 9 CFU / mL的密度。我们用P。假单胞菌株PAO1进行组成型表达GFP的6 pSMC21质粒。
  8. 添加到1毫升细菌培养无菌的离心管。在3分钟6000转离心,洗菌体两次在1毫升显微镜介质。
  9. 实现〜5X10 8 CFU / mL的浓度稀释成4.5毫升显微镜液0.5毫升的洗涤和悬浮细菌。
  10. 观察活细胞需要实时成像室,再加上蠕动泵(时间的延伸长度,以确保营养物质流)和温度控制器。我们使用Bioptechs FCS2(Focht活细胞)连接到一个低流量灌注微泵的1 / 16的C - flex公司管材切成适当的长度和不育蒸压室,并通过FCS2室控制器的温度调节。我们保持在37℃的热水,位于旁边的显微镜浴介质的输入源。
  11. 组装流室。 FCS2室包括自锁基地(坐在舞台上的适配器在成像)和灌注管和室内控制器相连的上半部分。会议厅内组装前翻转倒放在搬上舞台适配器。室的上半部分保持倒挂使灌注管是可见的,并灌注管到0.75毫米厚的橡胶垫片的通孔对齐。堆栈室顶部的橡胶垫片,确保沟槽一边是microaqueduct幻灯片,并将其放在另一个幻灯片上的橡胶垫片。这第二个垫片的厚度和内部几何确定腔的体积。我们通常用0.75毫米厚30毫米的圆形内部几何的橡胶垫片。
  12. 加入1 ml预热(37℃)显微镜在幻灯片的中心媒介。
  13. 检索从细胞培养孵化器的60毫米的菜,除去花中等,一次用3毫升的预热显微镜介质的细胞。此步骤可确保消除细胞生长介质中的酚红和抗生素。酚红轻度荧光灯和干涉成像,而抗生素可以消灭体育铜绿菌,才可以建立生物膜。
  14. 使用乙醇洗镊子,从盘检索的盖玻片,降低到磁珠上腔放在显微镜媒体倒挂。现在休息盖玻片上的第二个橡胶垫片和呼吸道细胞的单层朝下。
  15. 部件组装,一方面将堆栈的顶部室的基础,所以这一切都是右侧翻身迅速室。转动环,锁定到位的基地。
  16. 低流量微型灌注泵入口管连接,并开始在20 mL / h的速度流,这个流量是体育游泳的速度能力假单胞菌 。第二件显微镜介质放置在37瓶泵的油管链接℃水浴位于旁边的显微镜。
  17. 无菌预切1 / 16的C - Flex的油管连接到会议厅的入口和出口灌注管,连接温度控制器,然后放置到一个倒置荧光显微镜显微镜阶段的组装室。
  18. 使用1毫升的一次性注射器,注入室先前准备的菌悬液,使用两个单向阀置于行之间的泵室。在我们的特别设置的,它需要的菌悬液0.6 mL体积达到室。根据您的特定的油管长度调整本卷。我们还发现它有用的地方行的一次性0.22微米过滤器之间的泵和两个单向阀,以防止细菌从上游游泳和污染输入瓶。
  19. 为了使细菌附着于呼吸道细胞,停止泵为2h。流,然后可以重新开始,并维持在20毫升/小时,其余实验。
  20. 监视器微分干涉对比(DIC)的整个实验的显微镜呼吸道细胞的完整性检查单层损坏的迹象。同时,按照发展绿色荧光蛋白标记体育通过收购一个倒置的共聚焦或宽视场荧光显微镜图像的心尖在气道细胞表面的铜绿假单胞菌生物膜。

3。代表性的成果

我们用一个P 应变假单胞菌含有pSMC21质粒可组成型表达GFP的6。出于这个原因,绿色荧光蛋白标记的生物膜上CFBE单层的可epifluorescence显微镜观察。另外,可视化的生物膜可以通过染色未标注体育假单胞菌与1小时37℃1 1%calcofluor白色的解决方案。

CFBE细胞成像上形成生物膜的流动检测,我们使用一个特制的阶段适配器,但现在有几家公司可以提供专门安装阶段适配器。我们的工作与奥林巴斯IX70倒置ORCA - AG深冷CCD相机和X60油浸物镜(数值孔径1.40)配备显微镜。滤波器W配备了一个四十〇分之四百八十零纳米带通激发滤光片和一个30分之535纳米带通发射滤光片脚跟。数字图像被收购的OpenLAB 4.0.3软件包(即兴),卷迭代恢复使用Volocity 3.5.1软件(即兴)deconvolved。实现COMSTAT图像分析软件包7,8 3D生物膜结构定量分析。

对于任何合作文化模型认为,必须特别注意​​的细胞毒性模型的组件之间发展。在静态和流动细胞检测,我们发现CFBE单层,可以承受体育存在假单胞菌为接种后8小时,没有任何改动的迹象。上皮细胞单层的完整性进行评估相衬显微镜倒置显微镜 1(图1A)或微分干涉对比(DIC)的整个实验显微镜5。随着时间的推移, 体育绿脓杆菌会产生毒素和积累,并能损害的上皮细胞单层完全或部分(图1B - 1C)的致病因素。细胞毒性,可定量评估,使用各种工具包来衡量的上皮细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)。 LDH是一个稳定的胞内酶,裂解细胞或细胞死亡后的细胞外环境释放。

当呼吸道单层的完整性不受损害(通常为〜8 h后接种), P. 假单胞菌生物膜可以成功地形成和发展,双方合作的文化模型(图2A - 2B)在呼吸道细胞的顶端表面。继三维重建(图2C)和量化,生物量的积累,可以准确地确定。我们也使用这些共培养生物膜,在几个表型检测。例如,如上所述,生物膜CFU可以很容易地由上皮细胞裂解,连续平板稀释裂解,电镀。我们发现这种技术优势,确定不同菌株耐抗生素治疗。此外,生物膜对上皮细胞的毒性,可使用市售的LDH检测试剂盒。在这种方式下,生物膜的毒性致病因素的作用进行评估。这些模型系统还支持一些基因表达的应用,包括启动子融合的研究,RT - PCR和基因芯片分析 1,5,9, 。

图1
图1。 CFBE细胞和代表图像的单层损害和损害呼吸道细胞单层由于体育假单胞菌生物膜的生长。(一)代表形象,一个生长在组织培养板的CFBE细胞融合单层相衬显微镜评估。比例尺,120微米。 (二)折衷CFBE单层的例子。单层即使不显示没有明显的损伤明显的迹象,P。假单胞菌细菌之间的紧密连接的上皮细胞和基底膜获得的蔓延。生物膜的形成通常是没有实现在这些条件下,由于单层恶化的。比例尺,20微米。 (三)范例杂草丛生体育假单胞菌生物膜接种后观察24小时。成功后支持生物膜的形成,CFBE单层是无法修复的损坏,现在几乎不存在。残留生物膜,为细菌的平层增长,显示附加玻璃盖玻片。比例尺,20微米。

图2
图2。 体育 (一) 在根尖表面使用静态共培养生物膜模型和流动细胞共培养生物膜模型的融合CFBE细胞生长假单胞菌生物膜 。的表达GFP的体育形象代表在使用静态共培养生物膜模型,epifluorescence显微镜评估CFBE细胞融合单层假单胞菌生物膜生长。形象是相衬渠道的覆盖和荧光通道。比例尺,35微米。 (二)一个GFP标记P.的形象代表假单胞菌生物膜增长为6 h的使用流动细胞共培养生物膜模型CFBE细胞融合单层。为了方便呼吸道单层的可视化,核染色体育接种前30分钟为10微克/毫升赫希斯特33342(分子探针) 假单胞菌 。被看作微分干涉对比(DIC)的合并,pseudocolored图像,以及相应的荧光图像显示。生物膜,呈现根尖CFBE细胞表面附着的绿色团块,分布在呼吸道的细胞。比例尺,20微米。 (三)三维重构TION的Z系列图像显示典型的蘑菇状结构的H - 6岁的体育假单胞菌生物膜的形成上CFBE细胞单层。比例尺,10微米。

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Discussion

生物膜是细菌的社区环境刺激的反应形式。这些环境的信号导致全球监管的变化,在每个细菌,导致绑定到表面,聚集,胞外多糖生产,和其他表型,如抗生素耐药性增加10。在过去几十年里,大量的证据支持的假说,即生物膜在慢性感染的发病机制中发挥了很大的作用。举例来说,它是可接受的, 体育绿脓杆菌是能够建立在囊性纤维化(CF)患者肺部慢性感染,形成生物膜 11 。 CF是一种遗传性疾病,其中的CFTR基因突变导致不适当的氯化物分泌 12 。 CF患者通常会遇到改变导致呼吸道生理厚厚的粘液塞在呼吸道,同时,微生物感染 13 。到青春期后期,占主导地位的传染性病原体的CF航空公司 P。 绿脓杆菌 ,导致的一种慢性生物膜感染,耐抗生素 14 。

本文中所描述的协议已经开发作为模型系统,为学习生活肺细胞的生物膜形成。细菌生物膜有牵连的许多疾病状态,然而,非生物固体的表面,如玻璃和塑料15,16,大多已被研究。通过学习上唯一的非生物表面的生物膜的形成和增长,一方面是缺少的病原体和主机之间,只能出现,如在上述协议中所描述的模型系统的重要的相互作用。具体来说,静态共培养生物膜模型和流动细胞共培养生物膜模型的体育能力的优势假单胞菌对互动和绑定到肺的上皮表面。利用这些模型,我们已经表明,共培养生物膜的抗生素治疗的反应是独一无二的,这些模型更容易准确地反映传染病的状态1,5。在这方面,我们曾报道,由>耐妥布霉素增加25倍时, 体育假单胞菌生物膜生长在玻璃5,如非生物表面生长的生物膜相比,气道细胞。这是,这些技术很可能反映了事件发生在 17月初定植。因此,联合培养的模型系统,代表创新的工具,为了解 P. CF气道上皮细胞的早期感染假单胞菌 1。

组织培养系统通常被理解宿主与病原体之间的相互作用。我们已经采取了一步,这些相互作​​用活人的上皮细胞上形成生物膜。在未来,模型修改后的版本可能被用来调查其他传染病国家,不同的细菌生物膜的形成。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

我们要感谢G. Ø图勒在开发这些模型的指导和建议。囊性纤维化基金会(ANDERS06F0 GGA,STANTO07RO和STANTO08GA到BAS),美国国立卫生研究院(T32A107363 GGA和R01 - HL074175到BAS),这项工作是支持国家研究资源中心的生物医学研究的卓越中心(COBRE P20 - RR018787到BAS)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber Bioptechs 060319131616
FCS2 chamber controller Bioptechs 060319-2-0303
40 mm glass coverslips Bioptechs PH 40-1313-0319
MEM Mediatech, Inc. #10-010-CV
MEM without phenol red Mediatech, Inc. Mediatech, Manassass, VA

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References

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Comments

4 Comments

  1. HI thanks for this video it was really great. I was wondering if you have tried using A549 cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 12:28 PM
  2. Not to my knowledge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 5:27 PM
  3. Can this system be used to study effect of various antibiotics on P.
    aeruginosa biofilm formation

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2011 - 11:14 PM
  4. Yes, and we have done so (see references #1 and #5 of the protocol).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 8, 2011 - 1:42 PM

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