शीत शर्त से neuroprotection के अध्ययन के लिए रणनीतियाँ

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Summary

हम तंत्रिका प्रतिरक्षा ठंड शर्त के रूप में चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए उपन्यास लक्ष्यों की पहचान करने के लिए चोट शुरुआत से पहले मस्तिष्क की रक्षा का मतलब है के लिए जिम्मेदार संकेतन को परिभाषित करना चाहते हैं. हम ऐसे काम के लिए रणनीति है कि जैविक प्रणालियों, प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती से अधिक तकनीकी क्षमता है कि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील होते हैं की आवश्यकता है मौजूद है.

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Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

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Abstract

Protocol

बाँझ और सड़न रोकनेवाला तकनीक तैयारी, रखरखाव, और टुकड़ा संस्कृतियों की विस्तारित अवधि के लिए उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसके अलावा, इन विट्रो में 18 दिनों के बाद ही हमारे टुकड़ा संस्कृतियों के उपयोग के लिए तर्क के साक्ष्य पर आधारित है कि उत्तेजक इंगित करता है और निरोधात्मक synaptic प्रसारण सबसे परिपक्व हो जाता है, और glia (astrocytes और microglia) मौन और के साथ संगत हो vivo समकक्षों में उनके (चित्रा 1 ).

1. तैयारी और hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों के रखरखाव

  1. संवर्धन के एक ही दिन, 1.1 एमएल वृद्धि 50 एमएल बेसल मध्यम ईगल, 25 एमएल है Earle बैलेंस्ड नमक समाधान, 23 एमएल हार्स सीरम, 0.5 एमएल Glutamax (200 मिमी शेयर), 0.1 एमएल (gentamicin से मिलकर मीडिया में बाँझ आवेषण संतुलित 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर), 0.4 एमएल Fungizone (250 μg / एमएल), 1.45 एमएल ग्लूकोज डी (45%, कुल 42 मिमी).
  2. एक मशीन में 36 में छह अच्छी तरह से ट्रे रखें ° सी, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% आर्द्रता.
  3. बाँझपन के लिए अधिक से अधिक, संवर्धन आदर्श एक HEPA फ़िल्टर भी आत्म निहित अल्ट्रा वायलेट प्रकाश हवा सफाई प्रशंसकों के माध्यम से शुद्ध हवा के साथ सकारात्मक दबाव संस्कृति कमरे में किया जाता है, और एक साफ प्रयोगशाला कोट और बाँझ दस्ताने पहने हुए प्रयोगशाला कोट आस्तीन में फैला .
  4. BSL-1 लामिना धूआं हुड है कि जरूरत सभी सामग्री (यानी, McIlwain ऊतक चोपर, संबंधित Teflon आवेषण, रेजर ब्लेड टुकड़ा करने की क्रिया, ठंड विच्छेदन (3-4 डिग्री सेल्सियस) थाली, सर्जिकल उपकरण, और विच्छेदन पेट्री डिश) में टुकड़ा संस्कृतियों तैयार एक जंगली stereomicroscope (M8) का उपयोग.
  5. ठंडा प्लेट (पास में एक पानी के स्नान से चलाने) कम से कम 30 मिनट के लिए 3-4 डिग्री सेल्सियस तापमान तक पहुँचने के लिए, जबकि एक ही समय में पराबैंगनी प्रकाश विच्छेदन सामग्री को उजागर करने के लिए आगे विच्छेदन क्षेत्र और उपकरणों के बाँझपन स्थापित करने की अनुमति दें.
    1. लामिना का प्रवाह हुड समय - समय पर पराबैंगनी प्रकाश एक shortwave पराबैंगनी प्रकाश को मापने मीटर के साथ tabletop स्तर पर पर्याप्त शक्ति है करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया है.
  6. चूहे पिल्ले (P8-P9 और ~ 23 ग्राम / ea के जन्म के समय 10 से मारी गईं litters से.) के भीतर 100% इथेनॉल में सूई से 100% हुड धूआं और शुद्ध के पीछे एक सड़न रोकनेवाला बेंच पर एक छोटा सा जानवर बॉक्स में कार्बन डाइऑक्साइड के साथ anesthetized का प्रयोग करें धूआं डाकू, जहां सभी बाद के चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं.
  7. एक आधा में एक 100 मिमी पेट्री डिश के पिल्ले का सिर काटना और दूसरी छमाही में सिर जगह है, पिल्ला प्रति एक ताजा पकवान का उपयोग.
  8. बाहर मस्तिष्क काटना और यह एक 60 मिमी युक्त पेट्री डिश के नीचे आधा में जगह 10 एमएल बाँझ ठंड (3-4 डिग्री सेल्सियस) Gey बैलेंस्ड नमक डी ग्लूकोज के साथ 6.5 पूरक समाधान मिलीग्राम / एमएल (यानी, 45 की 7.5 एमएल % Gey है की 500 एमएल की बोतल प्रति घ - ग्लूकोज.
  9. प्रत्येक गोलार्द्ध से बाहर हिप्पोकैम्पस काटना और एक Teflon डिस्क पर उन्हें McIlwain हेलिकॉप्टर के लिए जगह. प्रसार मस्तिष्क एक परितारिका रंग का उपयोग करने के लिए कटौती ब्लेड काटने का पालन करने से मस्तिष्क वर्गों को रोकने के ऊतकों से दूर मीडिया.
  10. अपने लंबे McIlwain हेलिकॉप्टर खंड 350-400 सुक्ष्ममापी पर सेट मोटाई के साथ, का उपयोग कर अक्ष hippocampi सीधा धारा.
  11. Briskly हौसले स्लाइस काट और Teflon आवेषण के एक 60 मिमी पेट्री ठंड (3-4 डिग्री सेल्सियस) Gey 6.5 मिलीग्राम / एमएल डी का उपयोग कर एक एमएल pipettor ग्लूकोज के साथ बैलेंस्ड नमक समाधान युक्त डिश के शीर्ष छमाही में धो
  12. एक अक्षुण्ण दांतेदार गाइरस और पिरामिड सेल परत के लिए stereomicroscope के तहत स्लाइस का निरीक्षण किया.
  13. धीरे से एक डालने पर सबसे बड़ी स्लाइस (डालने के प्रति और तीन 12 स्लाइस / पिल्ला) की जगह और एक इनक्यूबेटर में सामान्य ऊष्मायन शर्तों के तहत बनाए रखने के हर छह महीने साफ और हर तीन महीने में एक अवरक्त कार्बन डाइऑक्साइड विश्लेषक और एक दशमलव स्थान के लिए सटीक थर्मामीटर के साथ कैलिब्रेटेड.
  14. ताज़ा संस्कृति बर्तन में वृद्धि मीडिया इन विट्रो में हर 3-4 दिनों एक BSL-2 डाकू और बाँझ तकनीक का उपयोग कर.
  15. इन विट्रो में 7 दिनों के बाद, 1.1 एमएल सीरम मुक्त मीडिया (SFM) 97 एमएल Neurobasal, 2 एमएल B27, 0.5 एमएल Glutamax (200 मिमी), 0.1 एमएल ascorbic एसिड (0.5 एम), और 0.68 एमएल के निर्वाचकगण के साथ मीडिया की जगह डी - ग्लूकोज (45%, 42 मिमी कुल).

2. प्री - स्क्रीन स्लाइस संस्कृति की जीवन शक्ति

  1. विभाज्य Sytox ग्रीन (10 μL) शेयर और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
  2. 500 एनएम सीरम मुक्त विकास मीडिया में एकाग्रता (यानी, 100 एमएल मीडिया में 10 μL) काम कर Sytox शेयर पतला. 4 में स्टोर Sytox मीडिया डिग्री सेल्सियस और एक सप्ताह के लिए उपयोग करें.
  3. प्लेस 1.1 6 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में अच्छी तरह से प्रति Sytox एमएल और 36 से गर्म डिग्री सेल्सियस 5% एक पर्याप्त अवधि के लिए कार्बन डाइऑक्साइड (यानी, घनीभूत संस्कृति बर्तन पर कमी द्वारा evidenced के रूप में).
  4. इस बीच, एक स्थिर बिजली की आपूर्ति के माध्यम से संचालित एक पराबैंगनी (यानी, एक FITC फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत) दीपक वर्दी प्रकाश तीव्रता सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए तापमान गर्म अनुमति देते हैं.
  5. प्लेस टुकड़ा संस्कृतियों (18 दिनइन विट्रो में) Sytox मीडिया में 10 मिनट के लिए और फिर वापस अपरिवर्तनीय CA1 पिरामिड परत चोट के लिए स्क्रीन के लिए SFM.
  6. एक औंधा माइक्रोस्कोप, 5x आवर्धन के तहत जांच की सड़न रोकनेवाला सतह पर संस्कृतियों देखें.
  7. 30 से कम CA1 क्षेत्र में Sytox सकारात्मक कोशिकाओं के साथ संस्कृतियों स्वीकारें.

3. शीत शर्त

  1. प्लेस SFM के 6 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में 1.1 एमएल. ठंडा मीडिया (उदाहरण के लिए, 30 ° C) एक मशीन (5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% आर्द्रता) में संतुलित करने के लिए उपयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए अनुमति दें. संस्कृति व्यंजन पर घनीभूत की अनुपस्थिति इंगित करता है संतुलन के लिए है कि पर्याप्त समय हुआ है.
  2. ठंडा (एमएल 1.1 अच्छी तरह /) एक BSL-2 धूआं हुड में 90 बाँझ तकनीक का उपयोग मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और सेते पर रखा ट्रे मीडिया टुकड़ा संस्कृति आवेषण स्थानांतरण.
  3. टुकड़ा संस्कृतियों को वापस सामान्य SFM में 24 घंटे के लिए सामान्य ऊष्मायन शर्तों के तहत रखें, फिर से एक BSL-2 धूआं हुड के माध्यम बाँझ तकनीक का उपयोग.

4. Excitotoxic चोट

  1. 20 मिनट के लिए Sytox मीडिया को उजागर द्वारा संस्कृति प्रयोगात्मक उपयोग prescreen टुकड़ा शुरू करो.
    1. एक prescreen (पृष्ठभूमि छवियों) के लिए इस्तेमाल किया है कि इसी तरह उन्मुखीकरण पर बनाए रखा स्लाइस के साथ अलग - अलग टुकड़ा छवियों मोल. यह बाईं ओर एक निशान रखने और मार्कर पेन के साथ दो अंक प्रत्येक डालने पर सही करने के लिए "10" और "दो" बजे के द्वारा किया जाता है. इस पैंतरेबाज़ी प्रत्येक छवियों का सेट संस्कृति के लिए ब्याज आकार का एक ही क्षेत्र का उपयोग करने की सुविधा है.
  2. उसी समय, पराबैंगनी दीपक स्रोत पर बारी है (विनियमित बिजली की आपूर्ति के तहत), और 20 ताकि वे तापमान को गर्म मिनट की एक न्यूनतम के लिए सीसीडी कैमरा.
  3. फिर, एक fluoroscein मानक के साथ सीसीडी कैमरा जांचना.
    1. 50 चक्र के लिए जब तक कि एक स्वत: औजार सीसीडी कैमरे का प्रयोग किया जाता है प्रकाश उजागर द्वारा "साफ़" सीसीडी. हम MetaMorph भीतर एक कार्यक्रम की स्थापना की है हमारे कूल स्नैप कैमरा चोट मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया स्पष्ट है.
    2. प्लेस 90 एमएल पीबीएस (10 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.3 पीएच पर 150 मिमी NaCl) और भंवर में 10 fluoroscein की μL.
    3. पिपेट एक 100 सुक्ष्ममापी गहरी hemacytometer पर fluoroscein मिश्रण के 10 μL.
    4. 1000/4096 पूर्ण छवि तीव्रता समायोजित करें.
  4. टुकड़ा संस्कृतियों की पृष्ठभूमि छवियों सत्यापित करने के लिए ठंड शर्त है कि चोट के कारण नहीं (यानी, 250 ≥ ब्याज तीव्रता के CA1 क्षेत्र के साथ संस्कृतियों त्यागने) ले लीजिए.
  5. NMDA मीडिया के साथ ट्रे तैयार.
    1. NMDA 10 मिमी शेयर समाधान कम से कम साप्ताहिक तैयार करें.
    2. Excitotoxic चोट के लिए, SFM में 20 50 सुक्ष्ममापी NMDA पतला और कम से कम 20 मिनट के लिए सामान्य ऊष्मायन शर्तों के संतुलित.
  6. NMDA मीडिया में 60 मिनट के लिए सामान्य ऊष्मायन शर्तों के तहत BSL-2 डाकू और बाँझ तकनीक, जगह आवेषण का उपयोग करना.
  7. NMDA बंद कुल्ला प्रत्येक डालने के तीन अलग - अलग 60 मिमी व्यंजन प्रत्येक युक्त 10 एमएल Neurobasal 36 सी. सेंटीग्रेड के गर्म में तीन बार की सूई के द्वारा आवेषण के तीन 60 मिमी धो बर्तन के प्रत्येक सेट के लिए अधिक से अधिक तीन आवेषण उपयोग मत करो.
  8. सामान्य ऊष्मायन शर्तों के संस्कृतियों लौटें.
  9. NMDA करने के लिए प्रदर्शन के बाद 24 घंटे चोट छवियों को ले लीजिए.
    1. Fluoroscein मानक के साथ कैमरे जांचना रूप में ऊपर वर्णित है.
    2. 20 मिनट के लिए Sytox मीडिया में रखें संस्कृतियों.
  10. चोट quantitate:
    1. सॉफ्टवेयर का प्रयोग MetaMorph, CA1 क्षेत्र के आसपास एक AOI आकर्षित.
    2. चयनित क्षेत्र के लिए उपाय तीव्रता "चोट."
    3. कॉपी और पेस्ट AOI "चोट" से "पृष्ठभूमि छवि".
    4. "चोट" और Excel में "पृष्ठभूमि" से मान दर्ज करें.
    5. Quantitate नियंत्रण और शीत preconditioned संस्कृतियों के लिए "अंश पृष्ठभूमि".
    6. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (जैसे, SigmaStat) का उपयोग करना, उचित सांख्यिकीय परीक्षण चलाने के लिए प्रायोगिक समूह (ओं) की तुलना में एक नियंत्रण समूह, जो हमेशा प्रत्येक प्रयोगात्मक चलाने के साथ शामिल किया जाना चाहिए की चोट की तुलना.
    7. नोट: यदि एक दिन के बाद चोट छवियों में चोट स्तर कम कर रहे हैं, बाहर ले दो तीन दिनों के लिए प्रयोग करते हैं. संस्कृतियों में संरक्षण चोट करने के लिए संवेदनशीलता की कमी (चित्रा 2) की वजह से नकाबपोश हो सकता है.
    8. नोट: "संरक्षण" के मुद्दे पर हमें चोट के स्तर को मापने और सभी तुलना के लिए (चित्रा 3) के अनुपात नहीं करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए प्रेरित किया.

5. शीत शर्त के साथ एप्लाइड सह उपचार

टुकड़ा संस्कृतियों का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि पर्यावरण शर्त हैएस सही नियंत्रित किया जा सकता है. यह है कि cytokine से संकेत का मतलब ठंड शर्त मापा जा सकता है मजाक उड़ाया है, और महत्वपूर्ण नोड पहलुओं काटना संग्राहक.

  1. पुनः संयोजक (उदाहरण के लिए, agonist) और प्रोटीन को निष्क्रिय प्रोटीन (जैसे, एंटीबॉडी या घुलनशील रिसेप्टर) नकल और मिलाना, क्रमशः, साइटोकाइन संकेतन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. सामान्य में, इन प्रोटीनों का पुनर्गठन कर रहे हैं और -20 डिग्री सेल्सियस पर छह महीने के भीतर उपयोग के लिए aliquots के रूप में संग्रहीत करने के लिए पर्याप्त bioactivity सुनिश्चित है.
  3. यहाँ, हम TNF-α संकेत घुलनशील TNF 1 रिसेप्टर (sTNFR1) का उपयोग कर निराकरण की अनुकरणीय उपयोग का वर्णन करता है.
    1. 0.1% गोजातीय पीबीएस में 50 μg / एमएल के एक शेयर, 20-50 μL मात्रा में विभाज्य, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान करने के लिए सीरम albumin में sTNFR1 reconstitute
    2. उपयोग के लिए पतला, sTNFR1 के लिए 200 / टुकड़ा संस्कृतियों विकास मीडिया में एनजी एमएल 36 से गरम डिग्री सेल्सियस और जगह sTNFR1 मीडिया में 20 ठंड शर्त करने से पहले मिनट के लिए टुकड़ा संस्कृतियों.
      1. नोट: विचरण कम, यह सबसे अच्छा है विकास मीडिया की एक बड़ी मात्रा में 200 एनजी / एमएल sTNFR1 पतला (यानी, 1:250 से 50 μg / एमएल विकास मीडिया के 10 एमएल में sTNFR1 शेयर कमजोर पड़ने 40 sTNFR1 μL की आवश्यकता है) बनाम sTNFR1 सीधे जोड़ने पकवान में प्रत्येक अच्छी तरह से (4.4 1.1 एमएल मीडिया प्रति μL).
    3. प्रत्येक डालने में अच्छी तरह से sTNFR1 से 200 मीडिया में एनजी / एमएल और जगह 1.1 एमएल पतला. मीडिया ° ठंड शर्त करने के लिए टुकड़ा संस्कृतियों 90 मिनट के लिए ऊपर वर्णित के रूप में उजागर करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए सी 30 के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति दें.
    4. प्लेस टुकड़ा 36 पर वापस संस्कृतियों ° मीडिया में sTNFR1 वर्तमान के साथ सी.
    5. 24 घंटे बाद 20 मिनट के रूप में पहले वर्णित के लिए Sytox मीडिया संस्कृतियों और बेनकाब पृष्ठभूमि छवियों को इकट्ठा करने के लिए कि ठंड शर्त संस्कृतियों घायल नहीं था सत्यापित.
  4. ऊपर वर्णित के रूप में डेटा quantitate.
  5. घटकों के साथ ताज़ा मीडिया इन विट्रो में हर 3-4 दिन.

6. तत्काल और शीत शर्त के बाद विलंबित Excitotoxic चोट

  1. ठंड शर्त के साथ तत्काल चोट.
    1. प्रदर्शन ठंड शर्त के रूप में ऊपर वर्णित है.
      1. बाद ठंड शर्त, 20 मिनट के लिए सामान्य ऊष्मायन संस्कृतियों वापसी.
      2. फिर एक घंटे के लिए 20-50 सुक्ष्ममापी NMDA चोट करने के लिए संस्कृतियों को बेनकाब.
      3. संस्कृतियों के ऊपर वर्णित के रूप में तीन बार कुल्ला और सामान्य ऊष्मायन के लिए वापसी.
      4. 24 घंटे के बाद, चोट फ़ोटो अधिग्रहण के रूप में ऊपर वर्णित है.
  2. ठंड शर्त प्रभाव विलंबित.
    1. प्रदर्शन ठंड शर्त के रूप में ऊपर वर्णित है.
    2. NMDA चोट के 24 घंटे के बाद के रूप में ऊपर वर्णित करने के लिए संस्कृतियों बेनकाब.
    3. के लिए चोट छवियों प्राप्त प्रारंभिक सुरक्षा की निगरानी ठंड शर्त के बाद तीन दिन के लिए आगे बढ़ें.

7. शाही सेना अलगाव

निम्न जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं एक टुकड़ा संस्कृति के लिए पहुंचा रहे हैं.

  1. विकास मीडिया और सामान्य ऊष्मायन से टुकड़ा संस्कृतियों 6-अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में 3 एमएल RNAlater स्थानांतरण करने के लिए शाही सेना को स्थिर. 4 ° C में तीन दिनों के लिए स्टोर तक के रूप में नीचे वर्णित संसाधित.
  2. धीरे डालने से ठीक एक टिप रंग और ठंड के 1 एमएल में ब्रश जगह के साथ टुकड़ा संस्कृति लिफ्ट (4 डिग्री सेल्सियस) एक 1.5 एमएल में पीबीएस (DNase, RNase, और डीएनए मुक्त) microcentrifuge ट्यूब.
  3. 30 सेकंड और हटायें पीबीएस सतह पर तैरनेवाला के लिए नमूने अपकेंद्रित्र.
  4. -80 पर स्टोर नमूनों डिग्री सेल्सियस
  5. टुकड़ा (~ 250 एनजी / ea.) बर्फ पर, संस्कृतियों पिघलना नमूने से अलग शाही सेना के लिए.
  6. शाही सेना पृथक निम्नलिखित प्रक्रियाओं है कि और अधिक विस्तार में वर्णित हैं और RNeasy माइक्रो हैंडबुक (Qiagen) से अनुकूलित के माध्यम Qiagen MicroRNeasy किट का उपयोग कर.
    1. प्लेस प्रत्येक microcentrifuge एक टुकड़ा संस्कृति युक्त ट्यूब में 350 μL बफर RLT (10 μL एमएल प्रति β-mercaptoethanol युक्त).
    2. 30 सेकंड के लिए vortexing द्वारा नमूने homogenize. ऊतक Triturate है, यदि आवश्यक (यानी, ऊतक गोली अभी भी दिखाई) एक डिस्पोजेबल मूसल का उपयोग कर जब तक पूरी तरह से बफर RLT में homogenized.
    3. प्लेस 70% इथेनॉल lysate मिश्रण और मिश्रण विंदुक में 350 μL.
    4. स्पिन एक स्तंभ और एक संग्रह ट्यूब में जगह (दोनों स्पिन स्तंभ और संग्रह ट्यूब Qiagen द्वारा प्रदान की जाती हैं) homogenate स्थानांतरण.
    5. अधिकतम गति से 15 सेकंड के लिए नमूना अपकेंद्रित्र. स्तंभ को रखें.
    6. अधिकतम गति 350 μL बफर RW1 प्लस अपकेंद्रित्र 15 सेकंड के लिए जोड़कर स्पिन स्तंभ धो लें. बफर त्यागें.
    7. DNase 70 μL 80 μL कुल मात्रा उपज RDD बफर में मैं स्टॉक के 10 μL पतला. पिपेट धीरे मिश्रण करने के लिए भंवर नहीं. नमूना प्रति जलमिश्रित DNase शेयर के 80 μL तैयार करें. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    8. 350 μL बफर RW1 जोड़ें स्पिन और 15 सेकंड के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र नमूना. संग्रह ट्यूब त्यागें.
    9. एक नया संग्रह ट्यूब का प्रयोग, नमूना 500 μL बफर RPE जोड़ने और 15 सेकंड के लिए और अपकेंद्रित्र बफर त्यागें.
    10. नमूना और 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र पर 80% इथेनॉल की 500 μL रखें. संग्रह ट्यूब त्यागें.
    11. ट्यूब खुला टोपी के साथ अधिकतम गति से 5 मिनट, संग्रह ट्यूबों त्यागें, और हस्तांतरण स्पिन एक 1.5 एमएल संग्रह किट के द्वारा आपूर्ति की ट्यूब के लिए स्तंभ के लिए centrifuging द्वारा स्पिन स्तंभों सूखी.
    12. स्पिन स्तंभ झिल्ली के केंद्र पर पृथक शाही सेना, जगह 14 μL RNase मुक्त पानी इकट्ठा. एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और तरल पदार्थ इकट्ठा.
    13. RNasin के 2 μL (1 / ते बफर में यू μL पतला) और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस जोड़ें ते बफर पीएच 8.0 से कम 10 मिमी (tris [hydroxymethyl] aminomethane) Tris, 1mm EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium नमक हाइड्रेट) के होते हैं.

8. शाही सेना मात्रा

  1. नोट: RNasin RiboGreen परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
  2. RNase मुक्त ते बफर में RiboGreen 1:200 पतला के रूप में निम्नानुसार है.
    1. ते (एमएल): 1; Ribogreen (μL): 5;
    2. ते (एमएल): 4; (μL) Ribogreen: 20;
    3. ते (एमएल): 6; (μL) Ribogreen: 30.
  3. आरएनए मानकों के रूप में तैयार कर रहे हैं.
    1. खमीर tRNA आरएनए मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है. tRNA संग्रहीत है (-20 डिग्री सेल्सियस) 1 के रूप में ते बफर में मिलीग्राम / एमएल.
    2. ते बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर 1:100 पतला, (DNase, RNase, और डीएनए मुक्त) का उपयोग कर 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए एक 1 / μg एमएल काम कर मानक उपज.
    3. ते बफर मंदक पहला जोड़ने, तब ते बफर में पहले से ही थाली कुओं में एक मानक / μg एमएल की उचित राशि के रूप में आसन्न तालिका में दिखाया गया है जोड़ने के द्वारा एक 96 - अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट परख थाली में सीधे मानक वक्र तैयार. प्रत्येक मानक के रूप में इस प्रकार के लिए कुओं नकली बनाओ.
      1. वॉल्यूम. एसटीडी की. (ΜL): 100, वॉल्यूम. (μL) ते: 0, अच्छी तरह से में शाही सेना (एनजी): 100;
      2. वॉल्यूम. एसटीडी की. (ΜL): 80, वॉल्यूम. (μL) ते: 20, अच्छी तरह से में शाही सेना (एनजी): 80;
      3. वॉल्यूम. एसटीडी की. (ΜL): 60, वॉल्यूम. (μL) ते: 40, अच्छी तरह से में शाही सेना (एनजी): 60;
      4. वॉल्यूम. एसटीडी की. (ΜL): 40, वॉल्यूम. (μL) ते: 60, अच्छी तरह से में शाही सेना (एनजी): 40;
      5. वॉल्यूम. एसटीडी की. (ΜL): 20, वॉल्यूम. (μL) ते: 80, अच्छी तरह से में शाही सेना (एनजी): 20;
      6. वॉल्यूम. एसटीडी की. (ΜL): 0; वॉल्यूम. (μL) ते: 0, अच्छी तरह से में शाही सेना (एनजी): 0.
  4. परख के रूप में तैयार है.
    1. 96 अच्छी तरह से थाली का नमूना कुओं के प्रत्येक के लिए ते बफर के 99 μL जोड़ें. सबसे कारगर तरीका यह करने के लिए एक multichannel pipettor का उपयोग है.
    2. प्रयोगात्मक नमूना कुओं के लिए शाही सेना के एक μL जोड़ें.
    3. अच्छी तरह से multichannel pipettor का उपयोग कर प्रत्येक के लिए पतला RiboGreen के 100 μL जोड़ें और pipettor के एक या दो स्ट्रोक के साथ triturate.
    4. 480 एनएम उत्तेजना और 520 एनएम उत्सर्जन पर एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक पर थाली पढ़ें.
    5. एक मानक वक्र आरएनए मानकों के मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ Microsoft Excel का उपयोग कर निर्माण.
    6. मानकों वक्र से उत्पन्न रैखिक समीकरण का उपयोग कर नमूने में शाही सेना सांद्रता की गणना.

9. SYBR ग्रीन मात्रात्मक पीसीआर

  1. पीसीआर प्रक्रिया एक साफ विशेष रूप से शाही सेना (चित्रा 4) के साथ काम करने के लिए सुरक्षित क्षेत्र में सबसे अच्छा कर रहे हैं.
    1. क्षेत्र और संभावित डीएनए संदूषण और पराबैंगनी प्रकाश 10% ब्लीच या RNase दूर के साथ प्रयोग के पहले RNase गतिविधि से संबंधित प्रयोगशाला के उपकरण शुद्ध करना.
    2. सभी प्रक्रियाओं के दौरान दस्ताने पहनें.
    3. सभी के रूप में किट के साथ प्रदान की प्रक्रियाओं के लिए RNase मुफ्त पानी का प्रयोग करें. DEPC (diethylpyrocarbonate) इलाज पानी का उपयोग मत करो.
    4. सभी पीसीआर से संबंधित ट्यूबों के तुरंत बाद से विदेशी डीएनए की मंदबुद्धि एयरोसोल संदूषण उपयोग करने के लिए बंद करो.
  2. विकास और ब्याज की mRNA लक्ष्य (ओं) के लिए प्राइमरों विशेषताएँ. इन विधियों पूरक तरीके में विस्तृत रहे हैं एट अल Hulse, तंत्रिका विज्ञान जर्नल ऑफ 13, 2008.
  3. सीडीएनए 30-200 iScript का उपयोग रिवर्स प्रतिलेखन के माध्यम से एनजी कुल शाही सेना से उत्पादन किया है.
    1. शाही सेना मात्रा शुरू करने की पसंद शाही सेना की कुल राशि नमूना (यानी, कुल के 10% -20%) के एक हिस्से पर RT-पीसीआर विश्लेषण प्रदर्शन करने के लक्ष्य के साथ उपलब्ध द्वारा निर्धारित किया जाता है.
    2. शाही सेना के शेष बड़ा भाग भविष्य के विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जाता है.
    3. iScript यादृच्छिक hexamers और oligo-dt प्राइमरों का एक मिश्रण है, और 20 μL की कुल मात्रा में एक संशोधित MMLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का इस्तेमाल करता.
    4. 25 के लिए प्रतिलेखन आय रिवर्स डिग्री सेल्सियस के लिए 30 से 50 मिनट, और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के लिए 42 ° सी द्वारा पीछा मिनट 85 पर बाद में विकृत ° 5 मिनट के लिए सी.
    5. ते बफर में 0.4 एनजी / μL आरएनए मात्रा शुरू करने के लिए अपने रिश्तेदार के अंतिम एकाग्रता सीडीएनए पतला.
  4. SYBR ग्रीन पीसीआर आधारित रणनीति सीडीएनए बढ़ाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    1. पीसीआर प्रतिक्रियाओं वास्तविक समय में निगरानी SYBR ग्रीन समावेश द्वारा निगरानी कर रहे हैं.
    2. 50 μL प्रतिक्रियाओं 3 मिमी 2 MgCl, 200 सुक्ष्ममापी dNTPs, 15 pmol आगे और रिवर्स प्राइमरों के प्रत्येक होते हैं, एक सुक्ष्ममापी fluorescein, 1x SYBR ग्रीन डाई, 10 (4 एनजी) μL टुकड़ा संस्कृति सीडीएनए और प्रतिक्रिया में 1.25 यू प्लेटिनम Taq पोलीमरेज़ 50 मिमी KCl और 10 मिमी Tris, 8.3 पीएच के निर्वाचकगण बफर.
    3. पीसीआर iCycler thermocycler है कि वास्तविक समय में डेटा एकत्र कर सकते हैं का उपयोग किया जाता है.
    4. साइकल चलाना मापदंडों 15 सेकंड विकृतीकरण (95 डिग्री सेल्सियस) 30 सेकंड annealing / एक्सटेंशन (60 डिग्री सेल्सियस) 45 बार दोहराया द्वारा पीछा से मिलकर बनता है.
    5. ऑप्टिकल माप annealing / विस्तार कदम के दौरान लिया जाता है और सीटी मूल्यों iCycler सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया है.
    6. ब्याज और β-actin के साइटोकाइन लक्ष्य के लिए सीडीएनए मानक घटता का निर्माण किया जाता है.
      1. प्रतिलिपि संख्या आणविक और प्लाज्मिड सीडीएनए का वजन जन से निर्धारित होता है.
      2. प्रतिलिपि संख्या / द्रव्यमान का मानक घटता निर्माण कर रहे हैं और प्रत्येक परख में शामिल कर रहे हैं.
      3. प्रत्येक सीडीएनए कमजोर पड़ने के लिए सीटी मूल्यों की नकल संख्या v. सीटी वक्र निर्धारित किया जाता है.
    7. Cytokine और β-actin की प्रतिलिपि संख्या स्तर मानक घटता का उपयोग कर नमूने के लिए निर्धारित कर रहे हैं.

10. प्रोटीन के लिए मात्रात्मक पीसीआर

मात्रात्मक वास्तविक समय qPCR सरणी स्क्रीनिंग एक बेहद संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कम स्तर भड़काऊ मध्यस्थ अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए जांच का मतलब है.

  1. SABiosciences से RT2 Profiler पीसीआर सरणी भड़काऊ मध्यस्थ जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों के लिए प्रयोग किया जाता है निम्नलिखित निर्माता द्वारा और अधिक विस्तार में वर्णित चरणों के साथ.
  2. परख 0.1-1.0 μg शाही सेना का उपयोग करता है. हम स्थानीय टुकड़ा (जैसे, CA1 जो जमा दो नमूनों से ~ 250 एनजी कुल आरएनए प्रदान करता है) क्षेत्रों या पूरे एकल स्लाइस कि कुल शाही सेना के एक समान राशि होती है का उपयोग करें.
  3. नमूना और नियंत्रण RNAs रिवर्स सीडीएनए लिखित हैं पहली बार एक कतरा किट (उदाहरण के लिए, # सी 03) का उपयोग.
    1. परिणामी सीडीएनए SYBR ग्रीन आधारित पीसीआर मिश्रण (# पीए 011) और 25 पीसीआर सरणी प्लेट (84 अद्वितीय प्रयोगात्मक जीन और 16 गृह व्यवस्था जीन मापने) के 96 कुओं में से प्रत्येक में aliquotted μL के साथ मिलाया जाता है.
    2. एक सरणी थाली प्रयोगात्मक नमूने के लिए तैयार है और एक दूसरे की थाली नियंत्रण के लिए तैयार है.
    3. नोट: SYBR ग्रीन मास्टर मिश्रण निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई थर्मल cycler - विशिष्ट है.
  4. थर्मल साइकिल चालन के एक 40 चक्र प्रोटोकॉल 95 डिग्री सेल्सियस पर 60 एक मिनट के एक विस्तार के कदम से बाद डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के विकृतीकरण कदम के निर्वाचकगण के साथ एक iCycler का उपयोग किया जाता है ऑप्टिकल डेटा विस्तार चरण के दौरान एकत्र की है. थर्मल साइकिल चालन पिघल वक्र 0.5 ° सी वेतन वृद्धि में 55-95 डिग्री सेल्सियस तापमान रेंज स्कैनिंग विश्लेषण द्वारा पीछा किया जाता है.
  5. इलाज और नियंत्रण प्लेटें में जीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति 2 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था - ΔΔCt प्रदान एक्सेल आधारित सॉफ्टवेयर का उपयोग विधि और गुना वृद्धि या नियंत्रण के सापेक्ष कमी के रूप में व्यक्त की.
  6. जीन अभिव्यक्ति में दो गुना बढ़ जाती है या कम हो जाती है के साथ आगे के मूल्यांकन के लिए माना जाता है.
  7. पीसीआर सरणी स्क्रीनिंग से पहचान (जैसे, ठंड शर्त के लिए # PARN-011A का उपयोग करके) जीन आगे confirmeघ qPCR का उपयोग.
    1. पीसीआर सरणियों की पहचान है जो जीन उत्तेजनाओं के जवाब में विनियमित रहे हैं.
    2. ठंड शर्त के उदाहरण में, हम आईएल - 11 जीन की पहचान के रूप में सकारात्मक ठंड शर्त के जवाब में विनियमित.
    3. विश्लेषण में अगले कदम के लिए पुष्टि की जाती है कि नए जीन की पहचान की qPCR परख ऊपर विस्तृत का उपयोग टुकड़ा संस्कृतियों में विनियमित है.

11. मल्टिप्लेक्स Microsphere फ्लो Cytometric प्रोटिओमिक परख

  1. ठंड शर्त के रूप में ऊपर वर्णित करने के लिए टुकड़ा संस्कृतियों बेनकाब.
  2. कुल प्रोटीन परख के लिए हार्वेस्ट टुकड़ा संस्कृतियों.
    1. धीरे डालने बंद स्लाइस 1 एमएल ठंड में एक ब्रश ठीक टिप और जगह का उपयोग कर (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस. लिफ्ट
    2. अपकेंद्रित्र ट्यूबों और टुकड़ा संस्कृतियों बंद पीबीएस हटायें. सूखी बर्फ पर रखें जब तक कटाई समाप्त हो गया है.
    3. -80 पर स्टोर ट्यूबों डिग्री सेल्सियस
  3. कुल प्रोटीन परख के लिए प्रदर्शन टुकड़ा संस्कृति नमूने homogenize.
    1. Homogenization के लिए सेल lysis बफर तैयार.
      1. निर्माता के निर्देशों (जैव रेड) के बाद, lysis बफर के 5 एमएल protease inhibitors जोड़ सकते हैं और बर्फ पर अलग सेट.
    2. प्लेस टुकड़ा संस्कृतियों और आंदोलन स्लाइस पर pipetting और नीचे एक 100 μL विंदुक टिप के साथ पांच बार lysis बफर के 100 μL 1 मिमी के लिए खुला काटा.
    3. डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए 4 में एक प्रकार के बरतन प्लेट नमूनों पर हिलाएँ.
    4. 4 में 15 मिनट के लिए 13,000 rpm पर नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    5. एक स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और बर्फ पर अलग सेट.
  4. कुल प्रोटीन परख प्रदर्शन.
    1. BSA तैयार करें (गोजातीय सीरम albumin) प्रोटीन मानकों.
      1. Reconstitute शेयर ultrapure पानी के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार BSA.
      2. प्रोटीन 0-1000 μg / एमएल, lysis बफर में पतला लेकर मानकों की तैयारी.
    2. काम किट निर्देशों के अनुसार की जरूरत अभिकर्मक की मात्रा की गणना.
      1. उदाहरण के लिए, (आठ मानकों + 18 अज्ञात नमूने) (दो प्रतिकृति) x (x 200 μL काम कर रहे नमूना प्रति अपेक्षित अभिकर्मक) = काम कर रहे एक 96 microplate अच्छी तरह से (जैसे, microsphere प्रवाह cytometric परख पर लोड करने के लिए आवश्यक अभिकर्मक की कुल मात्रा का 10.4 एमएल , नीचे देखें).
      2. जब मिश्रण अभिकर्मक अभिकर्मक बी के साथ, एक कुछ turbidity हो सकता है, लेकिन जल्द ही गायब हो जाना चाहिए.
    3. Microplate पर मानकों की 10 μL और नमूने लोड.
    4. कुओं में काम अभिकर्मक के 0.2 एमएल लोड.
    5. सील टेप के साथ microplate कवर और 30 सेकंड के लिए थाली प्रकार के बरतन को हिला.
    6. 37 में सेते microplate ° सी 30 मिनट के लिए.
    7. 595 एनएम तरंगदैर्ध्य पर एक प्लेट पाठक को पढ़ने से पहले कमरे के तापमान शांत करने के microplate (10 मिनट के बारे में).
    8. BSA मानकों के मापा absorbances के साथ Microsoft Excel का उपयोग एक मानक वक्र का निर्माण.
    9. मानकों वक्र से उत्पन्न रैखिक समीकरण का उपयोग नमूनों में प्रोटीन सांद्रता की गणना.
      1. Lysis बफर और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस के साथ सबसे कम मापा एकाग्रता के लिए सभी नमूनों पतला
  5. प्रदर्शन एकल plex और मल्टीप्लेक्स साइटोकाइन ऊतक assays (या तरल पदार्थ) के रूप में # 12 और 16 संदर्भ में पूरा विस्तार में उल्लिखित है.

12. Immunohistochemistry

  1. पीएलपी लगानेवाला के साथ 24 घंटे 10 एमएल 16% paraformaldehyde के निर्वाचकगण के लिए संस्कृतियों फिक्स, 1.096 ग्राम lysine, 0.42 ग्राम सोडियम फॉस्फेट, और 0.17 ग्राम सोडियम periodate ultrapure पानी (लगानेवाला 6.2 पीएच है) के साथ 80 एमएल की कुल मात्रा से भरा है.
    1. हम पाते हैं कि पीएलपी लगानेवाला एक सौम्य लगानेवाला है कि कम स्तर immunostaining है कि अन्यथा स्पष्ट नहीं हो अन्य fixatives का उपयोग का पता लगाने के की अनुमति देता है.
    2. संस्कृतियों 24 घंटे के लिए तय कर रहे हैं और फिर पीबीएस युक्त सोडियम azide (100 मिलीग्राम / एल) के लिए एक ठीक ब्रश के साथ स्थानांतरित.
  2. अस्थायी पूरे टुकड़ा संस्कृतियों के उज्ज्वल क्षेत्र immunostaining के रूप में ~ 50 rpm पर मिलकर मिलाते हुए सभी चरणों के साथ इस प्रकार पूरा किया है.
    1. टुकड़ा संस्कृतियों में 10 मिनट के लिए 3 एमएल पीबीएस तीन बार धोएं.
    2. 0.3% एच 2 2 हे टुकड़ा संस्कृतियों बुझाने.
      1. 30% एच 2 हे 2 पीबीएस में शेयर समाधान पतला.
    3. पीबीएस तीन बार, 10 मिनट प्रत्येक टुकड़ा संस्कृतियों में धो डालें.
    4. टुकड़ा संस्कृतियों को एक छह अच्छी तरह से 10 एमएल बकरी सीरम, 0.75 एमएल Triton एक्स 100, और 89.25 एमएल पीबीएस के मिलकर थाली में 3 एमएल अवरुद्ध समाधान में एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ब्लॉक.
      1. अवरुद्ध समाधान के लिए सीरम एक ही प्रजाति है जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी उठाया गया था से आना चाहिए.
    5. टुकड़ा प्राथमिक एंटीबॉडी में रात भर संस्कृतियों 4 बजे अवरुद्ध समाधान में पतला डिग्री सेल्सियस सेते
      1. छोटे कांच Pyrex पकवान कुओं के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की अधिकतम मात्रा में होना चाहिए 0.3 एमएल उच्च मात्रा के लिए थाली के किनारे चला देते हैं.
      2. एक humidified बंद कंटेनर में पकवान प्लेस. हम पक्षपाती फिल्म के साथ पकवान कवर नहीं के बाद वर्गों overlying फिल्म पर घूमती हो सकता है और आगे workup के लिए खो दिया है.
      3. सिर्फ उच्च एंटीबॉडी समाधान में स्लाइस प्रसारित पर्याप्त थाली प्रकार के बरतन की गति मिलाते समायोजित करें.
    6. कांच की थाली से स्लाइसें निकालें और पीबीएस में धो प्रति 10 मिनट के लिए तीन बार धो लो.
    7. माध्यमिक एंटीबॉडी में स्लाइस, जबकि एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मिलाते सेते हैं.
      1. छोटे कांच Pyrex व्यंजन का उपयोग करने के लिए 0.3 एमएल माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान लोड.
    8. Pbs, धोने प्रति 10 मिनट में तीन बार धोएं.
    9. 3'-diaminobenzidine (थपका) के साथ धुंधला हो जाना कल्पना.
      1. 3 एमएल डाइमिथाइल sulfoxide में 30 मिलीग्राम थपका भंग.
      2. फ़िल्टर थपका 54 एमएल पीबीएस के साथ दो # 1 फिल्टर कागज और धोने का उपयोग.
      3. तुरंत का उपयोग करने से पहले, 30% एच 2 2 हे 20 μL जोड़ने.
      4. कमरे के तापमान पर 5-7 मिनट के लिए थपका समाधान में संस्कृतियों सेते हैं.
      5. नोट: थपका एक कैसरजन है और ठीक से निपटाया जाना चाहिए. एक के रूप में चिह्नित एक धूआं हुड में संग्रहीत कंटेनर में सभी थपका समाधान के निपटान, और ब्लीच समाधान में सभी व्यंजन जगह थपका निष्क्रिय. सभी थपका समाधान अंततः संस्थागत सुरक्षा कार्यालय के माध्यम से खारिज किया जाना चाहिए.
    10. पीबीएस तीन बार में 10 मिनट प्रत्येक के लिए टुकड़ा संस्कृतियों धो लें.
    11. गीले माउंट जिलेटिन टुकड़ा संस्कृतियों (या silane) 100 μL पकवान आसुत जल में भंग साबुन के साथ लेपित स्लाइड्स. कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखी.
      1. स्लाइड warmers अत्यधिक गर्मी का उपयोग करने से बचें स्लाइड्स के लिए मुहिम शुरू की संस्कृतियों में खुर का कारण हो सकता है.
    12. निर्जलीकरण वर्गीकृत इथेनॉल (50, 75, 95, 95, 100, 100%) की एक श्रृंखला के माध्यम से 30 प्रत्येक सेकंड के लिए स्लाइड.
    13. दस मिनट प्रत्येक के लिए xylene चार बार के साथ साफ स्लाइड्स.
    14. का प्रयोग एक गिलास पाश्चर पिपेट, जगह स्लाइड के शीर्ष पर बढ़ते मीडिया की 0.1 एमएल और धीरे गठन बुलबुले हवा से बचने के coverslip. कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखी.
  3. प्रतिदीप्त immunostaining.
    1. धारा टुकड़ा 20 मोटी सुक्ष्ममापी एक cryostat का उपयोग करने के लिए संस्कृतियों.
      1. -16 डिग्री सेल्सियस आंतरिक तापमान, और -12 के लिए वस्तु ° तापमान के लिए सी cryostat सेटिंग्स समायोजित करें.
      2. धातु चक पर एक पानी की छोटी राशि पाश्चर विंदुक और सूखी बर्फ पर फ्रीज का उपयोग कर रखें.
      3. जमी चक के शीर्ष पर ऊतक टेक मीडिया की एक पतली परत डिस्क लागू करें.
      4. चक फ्रीज और cryostat चैम्बर तापमान के लिए संतुलित करने की अनुमति दें.
      5. धारा ऊतक - टेक मीडिया एक चपटी टुकड़ा फ्लैट संस्कृतियों बिछाने के लिए उपयुक्त सतह बनाने के लिए.
      6. चक के उन्मुखीकरण नोट जबकि इस सेक्शनिंग सेक्शनिंग कि बंद चक गिरने से बढ़ते मीडिया को रोकने के लिए एक सुसंगत कोण प्रदान करता है.
      7. जब जमी, बाहर चक और एक धारक में जगह ले लो. एक धातु रंग और एक टिप ठीक पेंट ब्रश का प्रयोग, रंग पर एक टुकड़ा संस्कृति स्लाइड पर स्थानांतरणऊतक टेक मीडिया पर चक चपटा परत के बीच.
      8. कम से कम 10 मिनट के लिए घुड़सवार टुकड़ा संस्कृति और चैम्बर के तापमान पर फ्रीज पर एक ऊतक टेक मीडिया की पतली परत रखें.
      9. "ट्रिम" बटन सक्रिय है, खंड टुकड़ा संस्कृति तक ऊतक टेक मीडिया के ऊपर परतों के साथ दिख रहा है.
      10. "ट्रिम" से 20 सुक्ष्ममापी पर "खंड" पूर्व निर्धारित करने के लिए स्विच करें.
      11. जिलेटिन लेपित स्लाइड्स है कि कमरे के तापमान और सूखी स्लाइड्स रात कर रहे हैं के साथ 20 सुक्ष्ममापी वर्गों उठाओ.
      12. मीडिया ऊतक - टेक स्लाइड्स पर दिखाई हो, लेकिन पीबीएस washes में घुल.
    2. Immunostaining.
      1. पीबीएस 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार में स्लाइड्स धो लें.
      2. 0.3% कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एच 2 2 हे, मिलाते में बुझाने .
      3. पीबीएस 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार में स्लाइड्स धो लें.
      4. SFX संकेत का उपयोग बढ़ाने, और कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में 30 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर वर्गों के शीर्ष पर सीधे एक घटक की कुछ बूँदें लागू होते हैं.
        • घटक के साथ ऊष्मायन एक 10% बकरी सीरम उज्ज्वल क्षेत्र immunohistochemistry में प्रदर्शन समाधान के साथ कदम अवरुद्ध की जगह.
      5. प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते स्लाइड्स 0.75% में ट्राइटन पीबीएस में 37 पर दो घंटे के लिए ° एक्स-100 सी. पतला
        • प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान सीधे स्लाइड के शीर्ष करने के लिए और लागू सेते humidified कक्ष में वाष्पीकरण को रोकने के.
        • किसी भी समाधान के एंटीबॉडी में सीरम शामिल केवल PBS और Triton एक्स 100 का उपयोग मत करो.
      6. पीबीएस 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार में स्लाइड्स धो लें.
      7. माध्यमिक एंटीबॉडी में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए सेते हैं और प्रकाश से स्लाइड्स की रक्षा.
        • 20 मिनट एंटीबॉडी समाधान में हो रहा से किसी भी समुच्चय को रोकने के लिए सभी फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी अपकेंद्रित्र.
        • एंटीबॉडी dilutions की तैयारी 0.75% का उपयोग ट्राइटन पीबीएस में X-100.
      8. पीबीएस 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार में स्लाइड्स धो लें.
      9. डुबकी आसुत जल में एक बार स्लाइड बंद पीबीएस से लवण धोने.
      10. प्रकाश से दूर सूखी कमरे के तापमान पर रात में, स्लाइड को कवर किया.
      11. Coverslip लम्बा Antifade मीडिया के साथ स्लाइड.
        • पिघलना घटक 5-10 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में एक और घटक की एक शीशी बी एक साथ मिक्स एक Pastuer पिपेट का उपयोग कर सावधान किया जा रहा समाधान में हवाई बुलबुले नहीं परिचय करने के लिए लगभग 1 एमएल जोड़ने.
        • अधिकतम गति से 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र बुलबुले को दूर करने के लिए.
        • Pastuer पिपेट, सावधान का उपयोग करने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले बनाने से बचने के स्लाइड के शीर्ष करने के लिए लम्बा मीडिया की एक पतली परत लागू करें.
        • धीरे से और रात में सूखी स्लाइड के शीर्ष पर कवर पर्ची, प्रकाश से दूर कवर जगह है.
      12. डबल लेबल फ्लोरोसेंट Immunostaining (चित्रा 5).
        1. इसके बाद के संस्करण के रूप में छोड़कर ही ऊष्मायन समाधान में दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी पतला वर्णित, फ्लोरोसेंट Immunostaining प्रदर्शन.
        2. एक ही समाधान में सभी माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और सेते के रूप में ऊपर वर्णित.
        3. सीरियल ऊष्मायन दो एंटीबॉडी का उपयोग अवधि कम immunostaining में हुई.

13. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. Hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों और microglia के रूप बाएं हाथ की छवि से पता चलता है एक ठेठ परिपक्व (यानी, इन विट्रो में 21 दिन) hippocampal टुकड़ा संस्कृति NeuN (हरी) के साथ दाग प्रिंसिपल न्यूरॉन्स के cytoarchitecture वर्णन. पिरामिड न्यूरॉन्स CA1 क्षेत्रों और CA3 और गड्ढा में दिखाए जाते हैंबाईं ओर गाइरस न्यूरॉन्स (डीजी) को खा लिया. स्केल बार 250 सुक्ष्ममापी है. दाहिने हाथ की छवि CA1 क्षेत्र से व्युत्पन्न है और उच्च शक्ति पर दिखाया परिपक्व टुकड़ा संस्कृतियों के भीतर मौन microglia के branched गुणवत्ता वर्णन. कक्ष microglial सतह मार्कर, cd11b के साथ चिह्नित किया गया. स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी है.

चित्रा 2
चित्रा 2. शीत hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में neuroprotection शर्त. संस्कृतियों Sytox ग्रीन, एक फ्लोरोसेंट चिह्नित मृत सेल मार्कर के साथ incubated हैं . शीर्ष पंक्ति नकली नियंत्रण संस्कृतियों से पता चलता है और नीचे पंक्ति को उजागर ° 90 मिनट के लिए सी 28 स्लाइस से पता चलता है. बाएं हाथ, पूर्व स्क्रीन छवियों CA1 चोट नहीं दिखा. सापेक्ष चोट रंग अंशांकन पैमाने ऊपरी बाएँ छवि में दिखाया गया है. मध्य पंक्ति छवियों के बाद 24 घंटे 20 सुक्ष्ममापी NMDA जोखिम रिश्तेदार टुकड़ा संस्कृति चोट दिखा. सूचना है कि नकली नियंत्रण चोट ठंड शर्त (सीपी) को उजागर संस्कृतियों की तुलना में अधिक है. परंपरागत रूप से, संस्कृतियों तो रातोंरात NMDA CA1 neuronal चोट स्तर और सी.पी. v. दिखावा के रिश्तेदार चोट को अधिकतम 20 सुक्ष्ममापी उजागर कर रहे हैं, चोट / अधिक से अधिक चोट के अनुपात के रूप में उल्लेख किया है. हालांकि, अधिक से अधिक चोट stimuli करने के लिए जोखिम शर्त से neuroprotection पर काबू पाने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता. तदनुसार, चोट / अधिक से अधिक चोट के अनुपात का उपयोग neuroprotection प्रतिबिंबित नहीं कर सकते शर्त से सही है. यह दाहिने हाथ की छवियों है कि शो सी.पी. अधिक से अधिक स्तर नकली नियंत्रण के उन लोगों की तुलना में कम कर रहे हैं में स्पष्ट है.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रारंभिक, पहले दिन की माप का उपयोग में चोट स्तर quantitate की उपयोगिता illustrating योजनाबद्ध ठंड शर्त प्रयोगों जैसा ऊपर वर्णित है, हम अनुपात (चोट / अधिक से अधिक चोट) का उपयोग करें कि पाया ठंड पूर्व कंडीशनिंग से neuroprotection अस्पष्ट सकता है . यह योजनाबद्ध से छोड़ दिया, जहां नकली चोट लाल रंग में दिखाया गया है और कहा कि देखा जा सकता है है के बाद नीले रंग में ठंड शर्त. एक दिन NMDA प्रदर्शन के बाद ठंड शर्त चोट v. ("5") नकली नियंत्रण के एक रिश्तेदार "3" स्तर, 40% neuroprotection के साथ संगत से पता चलता है. हालांकि, अगर एक पारंपरिक अनुपात (यानी, चोट / अधिक से अधिक चोट) का उपयोग कर प्रारूप प्रयोग किया जाता है, कोई सुरक्षा स्पष्ट है [यानी, (5 / 10) = नकली v. (3 / 6) के लिए 50% = ठंड शर्त के लिए 50% ]

चित्रा 4
चित्रा 4. Typial qPCR परिणाम दिखाया. ऊपरी वक्र आरएनए प्रतिलिपि v. पीसीआर प्रवर्धन (नीला) नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने (लाल) दिखाने के लिए दहलीज चक्र की संख्या. लोअर छवि चार नमूने (काले, हरे, पीले और बैंगनी) के लिए विशिष्ट प्रवर्धन प्रोफाइल से पता चलता है. सूचना उत्तरार्द्ध सीटी दहलीज चक्र (नारंगी लाइन द्वारा चिह्नित) 26.0 पर होते हैं, 29.5, 31.0, और 32.5.

चित्रा 5
चित्रा 5. डबल लेबल immunostaining qPCR और qPCR सरणी परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया एक टुकड़ा संस्कृति (लाल) आईएल 11 और NeuN (हरा, न्यूरॉन्स चिह्न) के लिए प्रोसेस किया गया था आईएल -11 के सेलुलर अभिव्यक्ति loci के लिए जांच करने के लिए.. सूचना है कि कुछ पिरामिड न्यूरॉन्स (तीर) आईएल 11 और NeuN धुंधला हो जाना (पीला) बताते हैं जबकि कुछ छोटे कोशिकाओं (तीर), astrocytes माना, दिखाने केवल आईएल 11 धुंधला हो जाना (लाल) में वृद्धि हुई है.

Discussion

मौलिक दो महत्वपूर्ण साइटोकाइन संकेत ठंड शर्त neuroprotection में शामिल प्रणाली का वर्णन करने के लिए महत्वपूर्ण अवधारणाओं 6 और 7 के आंकड़े में सचित्र हैं. सबसे पहले, साइटोकिन्स बेहद कम एकाग्रता सामान्य मस्तिष्क में अणुओं के संकेत हैं. बहरहाल, शारीरिक साइटोकाइन एकाग्रता परिवर्तन उनके जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने की क्षमता (चित्रा 6) की वजह से मस्तिष्क संरचना और समारोह (यानी, phenotype) बदलने के लिए एक विशाल क्षमता है. इसके अलावा, साइटोकिन्स अत्यधिक निरर्थक और इसी तरह के प्रभाव और एक एकल साइटोकाइन चर प्रभाव (चित्रा 7) हो सकता है हो सकता है कि एकाधिक साइटोकिन्स में pleiotropic हैं. इस प्रकार, सही ठंड शर्त (या अन्य शारीरिक शर्त उत्तेजनाओं), संबंधित संकेत चर के समग्र विश्लेषण निर्धारित किया जाना चाहिए से जन्मजात neuroprotection के लिए साइटोकाइन अड्डों की स्थापना के लिए. यह मल्टिप्लेक्स परख रणनीतियों के माध्यम से पूरा किया है. यह ठंड शर्त neuroprotection के साइटोकाइन "हस्ताक्षर" की स्थापना करेगा.

चित्रा 6
चित्रा 6. मस्तिष्क साइटोकाइन संकेतन का विद्युत चित्र अपार संकेत मस्तिष्क साइटोकिन्स के शारीरिक सांद्रता के अन्य अच्छी तरह से पहचाना समकक्षों की सांद्रता की तुलना में बिजली हूं . एकाग्रता दूरी के प्रतिलोम के रूप में प्रतिनिधित्व किया है, संदर्भ बिंदु के रूप में एक बिल्ली गलमुच्छा के साथ शुरुआत. (10 -1 एम काली मिर्च के एक अनाज के द्वारा सचित्र) सोडियम और पोटेशियम (10 -3 एक टमाटर से सचित्र एम) के लगभग 150 और 3 मिमी, क्रमशः के स्तर को बीचवाला मस्तिष्क अंतरिक्ष में मौजूद हैं, और अच्छी तरह से पहचाना में भूमिकाओं है तंत्रिका कोशिका electrophysiological समारोह. इसी तरह, पीएच (यानी, ~ 10 -7 हाइड्रोजन आयनों की एम स्तर और शिकागो lakefront के साथ 780 मीटर के रूप में सचित्र) और कैल्शियम (यानी, ~ 10 एम -8 दिखाया के रूप में 7.8 किमी McCormick से शिकागो lakefront के साथ एक उपग्रह Google छवि से देखा स्तर हाइड पार्क के पास शिकागो विश्वविद्यालय में रास प्वाइंट प्लेस). इसके अलावा, इन सांद्रता पर बीचवाला अंतरिक्ष के लिए जारी न्यूरोट्रांसमीटर स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्र गतिविधि को प्रभावित करते हैं. इसके विपरीत, साइटोकिन्स (मंगल ग्रह के लिए पृथ्वी से दूरी के रूप में दिखाया गया है) मस्तिष्क सांद्रता में दस लाख से अधिक बार कम समारोह को बदल सकते हैं.

7 चित्रा
7 चित्रा. जन्मजात साइटोकाइन रास्ते के इंटरएक्टिव संकेत साइटोकिन्स अत्यधिक निरर्थक और pleiotropic कि कई साइटोकिन्स में हैं. समान प्रभाव है और एक एकल साइटोकाइन चर प्रभाव हो सकता है सकते हैं. इस तरह की विविधता जटिल इंटरैक्टिव संकेत है कि ligands, रिसेप्टर्स, और phosphoproteins के स्तर पर होता है की वजह से उपजी है. इसके अलावा जटिलता तथ्य यह है कि मस्तिष्क सेल विशिष्ट जन्मजात साइटोकाइन, रिसेप्टर, और संबंधित phosphoprotein परिवर्तन के प्रत्येक सक्षम के साथ अलग सेल प्रकार के होते हैं की वजह से उपजी है. निदर्शी प्रयोजनों के लिए यहाँ, केवल जन्मजात साइटोकाइन संकेतन रास्ते (प्रतिरक्षा सेल के अध्ययन से प्राप्त) दिखाए जाते हैं. सादगी के लिए, मस्तिष्क एक एकल सेल (सफेद लाइन) जन्मजात साइटोकिन्स के लिए संभावित बातचीत दिखा (आईएल 1α और आईएल 1β (आईएल 1α / β), TNF-α, आईएल -6 के रूप में करने के लिए यहाँ भेजा के रूप में तैयार की है, IFN-γ और आईएल 10), (आईएल 1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, और आईएल 10R) रिसेप्टर्स, और phosphoproteins (यानी, ERK1 / 2, kinases (p38-MAPK p38) और JNK) और प्रतिलेखन कारक (एटीएफ-2, NFκB, और STAT3). उदाहरण के लिए, JNK, p38 MAPK और ERK1 / 2, जो एटीएफ-2 के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति हो सके TNF-α TNFR1 के माध्यम से संकेत. TNF-α भी सीधे जीन अभिव्यक्ति बदल NFκB सक्रियण के माध्यम से. साथ में, इन प्रतिलेखन कारकों के सक्रियण के आह्वान (तीर) में वृद्धि हुई और कम (कुंद अंत) साइटोकिन्स और उनके रिसेप्टर्स के रूप में संकेत की अभिव्यक्ति है. महत्वपूर्ण बात, इन रास्ते एक cytokine में है कि परिवर्तन (उदाहरण के लिए, TNF-α) अन्य साइटोकिन्स (जैसे, आईएल 1β) के प्रभाव उत्पादन दिखा. इस प्रकार, सही ठंड शर्त, तो संबंधित संकेतन चर के समग्र विश्लेषण निर्धारित किया जाना चाहिए से neuroprotection के लिए साइटोकाइन के अड्डों को स्थापित करने के लिए. यह ठंड शर्त सहज cytokine "हस्ताक्षर" की स्थापना करेगा. (छवि # 25 संदर्भ के डेटा से संकलित किया गया था.)

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक (एन एस 19,108), माइग्रेन रिसर्च फाउंडेशन, और रिचर्ड पी. Kraig व्हाइट फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. सुश्री मेरिको पी. Kraig संस्कृति मीडिया और टुकड़ा संस्कृतियों के रखरखाव की तैयारी में सहायता की. हम उसे इस आलेख के अंतिम संस्करण पर संशोधन और टिप्पणियों के लिए येलेना Grinberg धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

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References

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