Induction et notation clinique de chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale

Biology

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Summary

Cette vidéo montre le score d'induction et cliniques d'un modèle animal de sclérose en plaques: chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale chez des rats DA. La maladie, provoquée par les rats immunisant avec une émulsion contenant la moelle épinière de rats et de toute l'adjuvant complet de Freund, présente des signes cliniques ressemblant à la maladie humaine.

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Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

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Abstract

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) qui touche généralement les jeunes adultes. Elle se caractérise par une démyélinisation et effrayer gliales dans les zones diffusées dans le cerveau et la moelle épinière. Ces lésions modifient la conduction nerveuse et provoquer des déficits neurologiques invalidantes qui varient avec l'emplacement des plaques démyélinisées dans le SNC (paraparésie par exemple, paralysie, cécité, incontinence).

Auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle pour la SEP. EAE a été induite par accident chez les êtres humains lors de la vaccination contre la rage, en utilisant des virus cultivés sur la moelle épinière de lapin. Les résidus de la colonne vertébrale avec injecté le virus inactivé induit la maladie du SNC. Suite à ces observations, un premier modèle de l'EAE a été décrit dans des primates non humains immunisés avec un homogénat SNC par Rivers et Schwenther en 1935. EAE a depuis été générés dans une variété d'espèces et peut suivre des cours différents en fonction de l'espèce / souche et les immunisant antigène utilisé. Par exemple, en immunisant des rats Lewis avec la protéine de myéline de base dans l'émulsion avec un adjuvant induit un modèle aigu de l'EAE, tandis que le même antigène induit une maladie chronique chez les porcs Guinée.

Le modèle décrit ici est l'EAE induite par la vaccination contre la moelle des rats DA DA épinière du rat en émulsion dans l'adjuvant complet de Freund. Les rats développent une paralysie ascendante flasque dans les 7-14 jours post-vaccination. Les signes cliniques suivent un cours rémittente pendant plusieurs semaines. Pathologie montre de grandes s'infiltre immunitaires dans le SNC et des plaques de démyélinisation. Considérations particulières pour prendre soin des animaux avec l'EAE sont décrits à la fin de la vidéo.

Protocol

L'induction et la surveillance des maladies chroniques récurrente EAE

L'émulsion est un mélange 1:1 de l'antigène en solution aqueuse ajoutée à compléter l'adjuvant complet de Freund. Il est très important d'ajouter l'antigène à l'adjuvant et non l'inverse!

Il ya beaucoup de déchets lors de l'injection et une émulsion. Toujours préparer 1,5 ou 2 fois plus que ce dont vous avez besoin.

Utiliser le mortier autoclavés, pilon, seringues en verre, et les ponts. Tous les plastiques doivent être stériles. La préparation peut être faite sur une paillasse de laboratoire régulières.

1. Préparation de l'adjuvant complété

Peser 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (catalogue # 231141 Difco) et mettre dans un mortier. Faire en poudre fine sans appuyer trop fort pour éviter de casser les bactéries. Ajouter 10 ml d'adjuvant complet de Freund H37Ra (Difco catalogue # 231131) et mélanger. Cet adjuvant contient maintenant complété 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis. Transférer dans un tube.

2. Préparation de l'homogénat de la moelle épinière

Recueillir la moelle épinière des rats de DA (âge / sexe indifférent) et de conserver congelés à -80 ° C. Peser les cordons congelés épinière d'avoir assez pour mélanger 1:1 (poids: volume) avec l'adjuvant complété. Emincez les moelles épinières aussi fine que possible avec une lame de rasoir, le transfert au mortier utilisé dans la section 1, et faire une pâte avec le pilon.

3. Préparation de l'émulsion

  1. Placez complété adjuvant complet de Freund dans un tube. Vortex à vitesse élevée. Ajouter la chute de la moelle épinière homogénat à goutte tout en vortex. Lorsque tous les homogénat de la moelle épinière est ajouté, vortex pendant 5 minutes. Le mélange doit tourner rose pâle.

  2. Mettez l'émulsion dans une seringue de 5 ml en verre et le lier à une autre seringue en verre de 5 ml à l'aide d'un pont 18G (catalogue Fisher n ° 14-825-17L). Envoyer l'émulsion d'une seringue à l'autre jusqu'à ce qu'il devienne dur (5-10 min). Si plus de 5 ml d'émulsion est préparée, l'utilisation de plusieurs seringues de 5 ml NE PAS utiliser de plus grandes seringues.

  3. L'émulsion peut être stockée dans les seringues à 4 ° C pendant 3 semaines. Je recommande le préparer au moins 12 heures à l'avance pour vérifier qu'il ne se décompose pas. Il devrait rester épaisse et non séparée en 2 phases. La couleur va changer du jour au lendemain d'une lumière jaune ou beige.

4. L'immunisation des rats

  1. Mélanger l'émulsion dans les seringues pendant quelques minutes et le transfert à la seringue utilisée pour l'injection. Injecter 200 pi sous-cutanée à la base même de la queue à l'aide d'aiguilles 23G et 3 ml Luer-Lock seringues sous anesthésie de courte durée.

  2. Les récipiendaires sont 7-9 semaines vieilles femelles rats DA. Nous obtenons nos rats de Harlan-Sprague-Dawley.

  3. Les rats doivent être observées deux fois par jour et pesés quotidiennement. Les signes cliniques sont attendus 7-15 jours après l'injection de l'émulsion.

Score clinique:

0: pas de maladie

0.5: la queue distale boite

1: la queue molle

2: paraparésie doux, une ataxie

3: paraparésie modérée, les déplacements des rats de temps en temps

3.5: un des membres postérieurs est paralysé, l'autre se déplace

4: paralysie complète des membres postérieurs

5: paralysie complète des membres postérieurs et de l'incontinence

6: moribonde difficulté à respirer, ne pas manger ni boire. Euthanasier immédiatement.

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Discussion

Il ya quelques considérations importantes pour ce protocole.

Génétique de rats DA diffèrent légèrement selon le sélectionneur, ils sont achetés à partir. Ces différences peuvent augmenter ou diminuer la sensibilité des rats à l'EAE induction. Si vos rats sont plus sensibles à l'EAE, vous voulez réduire la force de la vaccination en utilisant non complétées adjuvant complet de Freund ou encore l'adjuvant incomplet de Freund. Vous pouvez également envisager de réduire la quantité d'émulsion injectée ou de dilution de l'homogénat de la moelle épinière avec une solution saline avant de préparer l'émulsion. Si votre rat ne se développent pas de signes cliniques de l'EAE utilisant la pleine puissance immunisant émulsion vérifier la propreté de votre installation de logements. Les rats infectés par des parasites (comme les oxyures) ne se développera pas EAE. Vous pouvez considérer le logement de vos animaux dans des conditions plus propre dans des cages autoclavées avec filtre-tops, et en leur donnant ad libitum eau acidifiée (le protocole pour la préparation de l'eau acidifiée est jointe).

L'émulsion doit être de l'eau dans l'huile pour que l'huile dans le traitement adjuvant enduire complètement l'antigène vous ajoutez goutte à goutte. Une émulsion préparée dans l'autre sens (huile dans eau) va devenir aussi épais mais ne sera pas encéphalitogène.

Les rats sont des animaux amicaux s'ils sont habitués à leur gestionnaire, il est donc une bonne idée de les manipuler délicatement sur une base quotidienne avant l'injection de l'émulsion encéphalitogène. Cela permettra de réduire le stress et le risque d'une morsure.

Animaux avec EAE sévère (score de 3 ou plus) besoin de soins spéciaux. Les rats ne doivent jamais être pris par la queue, mais plutôt par l'organisme. Ceci est encore plus important pour réduire le stress chez les animaux malades. Il est très important de s'assurer que tous les animaux ont accès à la nourriture et l'eau en mettant paquets de nourriture et de gel dans la literie et la fourniture à long sipper tubes sur les bouteilles d'eau. Les rats avec EAE continueront de manger et de boire, si un arrêt des animaux manger ni boire de consulter le vétérinaire de votre institut ou de l'euthanasier l'animal. Rats malades doivent être séparés des animaux sains afin de s'assurer qu'ils ne sont pas constamment bafoués, mais il faut éviter les rats laissant seul car ils sont des animaux sociaux et besoin de compagnie.

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Disclosures

CB et KGC sont co-fondateurs et des consultants pour Airmid Inc

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

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Comments

21 Comments

  1. Dear Dr. Beeton,
    I watched your video with great interest.
    I am a researcher at the CEA, Orsay, France, and we are interested in inducing EAE in DA rats. I would kindly like to ask you a few questions in this regard:
    1. Should the meninges be removed prior to the freezing of the spinal cord, to avoid aggregates/ clumps in the emulsion?
    ². Is it possible to reduce the spinal cord into fine powder by using a mortar and pestle in liquid nitrogen rather than using a razor and cutting it over dry ice?
    3. Can the emulsion be prepared by using a polytron or some other homogenisation system rather than the glass syringes and the connecting bridges (we seem to have a problem to obtain some of these tools).
    4. Is it possible to use rats older than 7-9 weeks or dŒs susceptibility decrease with increasing age?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 5, 2008 - 11:20 AM
  2. We use whole spinal cords, without removing any parts.
    Since we published this video and following advice from Dr. Holmdahl (Lund, Sweden), we have started using fresh spinal cords from ~1² weeks old DA rats. The emulsions give more homogeneous diseases when working with a large group of animals (> 40 recipients). We have not tried using a mortar and pestle. I don't think it would work for fresh cords but might on frozen cords.
    I haven't tried any other methods for preparing the emulsion. As a graduate student in France I was able to buy glass syringes but we had to ask facilities to make metal bridges to connect the syringes by using two metal needles.
    Recipients should be young adults for best susceptibility to EAE. We have never tried using older DA rats but in other rat models of EAE (using Lewis rats) we have found that the older the recipients, the less susceptible to EAE they were. Note that not all DA rats are identical, there are small variations from vendor to vendor so you may want to try rats from several vendors in your area to find which are more susceptible to EAE.
    If you have any more questions you are welcome to contact me by email at beeton@bcm.edu.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    February 5, 2008 - 4:02 PM
  3. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. I would like to ask you , if you have any experience with the EAE induction in mice using this protocol. Thank You for the answer. Sincerely Jan Pazour

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 30, 2008 - 9:31 AM
  4. I have never used this protocol in mice. For mice I have only used the MOG 35-55 peptide to induce EAE [in C57BL/6 mice]. Using whole spinal cord should work in mice but the protocol would have to be adjusted. You would first have to ensure you are working with the right strain and then you would have to work out the doses and type of adjuvant. Most protocols in mice also call for an additional injection of pertussis toxin and very often mice need a booster injection to develop EAE. This can be a rather tricky protocol to adapt to mice. Sorry that I could not give you a more helpful answer.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    June 30, 2008 - 10:38 AM
  5. Dear all, could there be any difference in using M.butyricum instead of M. tuberculosis H37RA containing adjuvant in inducing EAE in wistar rats (mylein basic protein- MP bio-vendor). I plan to use the former.Please suggest.

    raghul
    toxicologist
    SGS -LSS india

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2008 - 1:24 PM
  6. Dear Raghul, I have no experience inducing EAE in Wistar rats so am unsure of the results. When inducing acute EAE in Lewis rats with MBP we used CFA made with M. butyricum and supplemented it with 3 mg/ml M. tuberculosis and this worked well with 100% EAE incidence and a homogeneous disease. Best wishes, Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    August 25, 2008 - 5:46 PM
  7. what is the concentration of the HCl for drink wather?

    Reply
    Posted by: Andres Q.
    September 15, 2009 - 2:40 PM
  8. To prepare acidified drinking water, fill a clean carboy with 10 liters of water. Add 5 ml of 1²N (concentrated) hydrochloric acid (HCl) to the water and stir. The pH of the solution should be in the range of ².4-3.0.
    For more safety, ensure that your stock of concentrated acid is not used for anything else but preparing acidified drinking water. This will reduce the risk of accidental contamination with toxic chemicals.
    Do not check the pH directly in your carboy but rather in a sample taken into a beaker.
    This acidified drinking water is not quite as acidic as common sodas many people drink every day. It will not damage the lining of the Œsophagus of the rats.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2009 - 3:03 PM
  9. Dear Dr Beeton,
    I found and watched with great interest you movie about induction and clinical
    scoring of chronic-relapsing EAE in rats and i would like to ask you if
    you have some hystological or/and MRI findings to prove that the major
    pathophisiologycal changes, induced by the immunization, occur in the brain
    and not in the spinal cord? How much this animal model mimics what is
    happening in human brain in MS? I am interested more by demyelination
    which i can observe using DT-MRI.

    Thank you in advance

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 8:32 AM
  10. We have not done any histology the brain of these animals as our focus was on the spinal cord.
    We used the brains to isolate mononuclear cells and found more with a CCR7- differentiated phenotype in EAE rats than controls. This suggest brain-infiltration and therefore a potential for demyelinating lesions, but I can't guaranty it.
    This model is definitely demyelinating in the spinal cord (see figure S6 in the online supplement of the paper Matheu, Beeton et al. Immunity ²008, ²9:60²).
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 1:54 PM
  11. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. Do you have the protocol to induce EAE in mice? Can you please provide injecting protocol for mice. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2010 - 1:24 PM
  12. The protocol will depend on the mouse strain you are interested in. Some strains are more susceptible to EAE than others. A good place to start is the following protocol: http://www.penningerlab.com/uploads/media/EAE_induction_01.pdf

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 30, 2011 - 11:34 PM
  13. Dear Dr Beeton
    Thanks for the vieo, it is very helpful. I have just one question regarding the part you use as "SPINAL CORD". Is it seperated from spinal column or you just use spinal colum containing spinal cord?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2011 - 5:01 AM
  14. You want to use the spinal cord itself, removed from the bone. It is pretty easy to collect since you don't need to keep it in a single piece (as you would for histology for example). You can simply scrape it out.
    Hope this helps!
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2011 - 4:36 PM
  15. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. Please let me know how to make acidified water and HOW LONG THE ANIMAL SHOUL DRINK SUCH A WATER BEFORE INDUCTION OF EAE?
    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 3:58 AM
  16. For preparation of the acidified water, please refer to my answer to a similar question from Andres Quintanar, posted 09/15/²009.
    We put our rats on acidified water as soon as we receive them, which is 4-7 days before we induce EAE.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 4:40 PM
  17. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. It is really helpful. Can we use Sprague-Dawley and Wistar Rats. Do we need in your model to use pertussis toxin.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2011 - 6:32 AM
  18. Hello Dear Christine Beeton
    Thanks for your useful video. I would be grateful if you response my question: In this video when you work with Mycobacterium tuberculosis H37RA for making it thin powder, you didn't wear mask, is it safe for you?

    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2012 - 5:34 AM
  19. Hello Dear Professor Beeton
    I have another question dear Dr Beeton: Should we perfuse the rat before spinal cord isolation (for EAE induction) or no the perfusion is just necessary when we want to isolate the cells from spinal cord or brain? I want to isolate the guina pig spinal cord for EAE induction and I don't know the perfusion is necessary or no.
    Best Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 10, 2012 - 7:46 AM

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