В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

* These authors contributed equally
Published 9/10/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Этот протокол описывает надежный метод обезболивания и обработки изображений интактных

Cite this Article

Copy Citation

Zhang, Y., Füger, P., Hannan, S. B., Kern, J. V., Lasky, B., Rasse, T. M. In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution. J. Vis. Exp. (43), e2249, doi:10.3791/2249 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Последние достижения в оптических изображений, генетически закодированы флуорофоров и генетических инструментов, позволяющих эффективное создание желаемых трансгенных линий животных позволили биологических процессов, которые будут изучены в контексте жизни, а в некоторых случаях даже себя, организм. В этом протоколе мы опишем, как обезболить нетронутыми личинки дрозофилы с использованием летучих анестетиков десфлуран, следить за развитием и пластичность синаптических населения на субклеточном разрешение 1-3. Хотя другие полезные методы, чтобы обезболить личинки дрозофилы были ранее описаны 4,5,6,7,8, протокол, представленные здесь, демонстрирует значительное улучшение за счет следующих комбинированных ключевые особенности: (1) очень высокая степень обезболивания, и даже сердце билось арестован позволяет пространственным разрешением до 150 нм, 1, (2) высокая выживаемость> 90% в обезболивания цикла, что позволяет запись более пяти временных точках в течение периода от нескольких часов до нескольких дней и 2 ( 3) высокая чувствительность позволяет нам в 2 случаях для изучения динамики белков, высказанные на физиологическом уровне. В деталях, мы смогли визуализировать постсинаптических субъединицы рецептора глутамата GluR-IIA выражается через эндогенные промоутер 1 в стабильной трансгенных линий и линии экзона ловушку FasII-GFP 1. (4) В отличие от других методов 4,7 личинки могут быть отображены не только жив, но и без изменений (т.е. не расчлененный), что позволяет наблюдения происходят в течение нескольких дней 1. Сопровождающих детали видео функции отдельных частей в естественных изображений камера 2,3, правильной установке личинки, обезболивания процедуры, как заново определить конкретные должности в личинки и безопасного удаления личинок из изображений камеры.

Protocol

) Ассамблея изображения камеры

  1. Выберите личинки выбрали этапе (например, ранний 3-го возраста личинки оставляя интервале наблюдения около 24 часов при 25 ° С до блуждающих этап).
  2. Промыть водой личинки, чтобы очистить его от питательной среды и промокните насухо.
  3. Пальто центре нижней элемент камеры, регион к лицу личинки, с тонкой пленкой галоидоуглеводородов нефти.
  4. Положите личинки с вентральной стороне, обращенной объектива микроскопа в камере (позволяет нервно-мышечном соединении (NMJ) 26 и 27 для включения в образ) (рис. 1 АЕ).
  5. Место пластиковую прокладку на масляный слой, с воздуха слоты сетке лицом вверх (рис. 1). Пожалуйста, убедитесь в этом шаге: высота спейсера примерно половину личиночной диаметре, ширина щели должна быть примерно в два раза диаметр личинки.
  6. Место изображения камеры на микроскоп

Б) обезболивания личинки

  1. Подключите два входа в камеру с соответствующим обезболиванием устройство / испарителем.

    Проверьте авансовые:

    Эффективная концентрация десфлуран в комнате воздуха не должна превышать величину, указанную на правила техники безопасности! Лишь очень небольшая общего объема десфлуран необходимо для обезболивания личинок. Применение 15% (объем / объем) десфлуран 1 оказалась хорошей отправной точкой для определения идеальной концентрации, которые будут использоваться в эксперименте. По соображениям безопасности мы рекомендуем испаритель никогда не должны содержать больше, чем нужно десфлуран в течение 2-4 часов в визуализации естественных условиях.
  2. Погрузите другом конце трубки прикреплен к камере выход в стакан с водой затем открыть клапаны регулирования потока анестетика в камере в течение примерно пяти секунд.

    Пожалуйста, проверьте на этом этапе:

    Есть ли пузырьки воздуха поднимаются в воде? Если нет камеры вытекающих.
  3. Закройте клапаны в течение примерно трех секунд.
  4. Монитор остаточного личиночной движений в микроскоп. Проверьте оба сердца и мышечных движений. При необходимости открытия и закрытия клапанов, как описано в шаге 8 и 9, пока обезболивания личинки полно, то закрыть все клапаны и начать съемки.

    Пожалуйста, проверьте на этом этапе:

    Остаточная движения мышц или сердцебиение указывает, что личинки не правильно наркозом. Полное обезболивание является жизненно важным для изображений с высоким разрешением. Личинка правило, не должен быть под наркозом в течение более 15-20 минут в данный момент времени.

С) изображений

  1. Определите правильное положение и имидж структуры процентных (рис. 2-4).

D) Восстановление после анестезии

  1. После завершения визуализации позволяют воздуха в камере.

    Пожалуйста, проверьте на этом этапе:

    Проверьте биение сердца и мышечных сокращений личинки в проходящем свете галогенных. Как мышцы начинают договаривающиеся это безопасно для удаления личинок из камеры изображений.
  2. Отсоедините камеру от обезболивания устройство и удалить его из микроскопа. Разберите камеру тщательно и месте личинки в пюре среду культивирования летать.
  3. Магазин блюдо в инкубаторе при соответствующей температуре.

Е) Временные ряды

  1. Повторите шаги 2-14 до достаточного моменты времени были получены.

    Альтернативный протокол:

    Если личинка для включения в образ больше, чем один раз в течение 30-минутного интервала может быть практичным, чтобы оставить его в камере изображение до следующего момента времени обезболивания. Повторите шаги 7-14 до достаточного моменты времени были получены.

    Пожалуйста, проверьте на этом этапе:

    Личинка не иметь в камере изображения в течение более двух часов за один раз, и это не должны быть под наркозом в течение более 15-20 минут за один раз.

Рисунок 1
Рисунок 1 Ассамблеи изображения камеры. () Место личинки и пластиковую прокладку на масляный слой. (Б) Место 22 х 22 мм покровным стеклом на втулку и вставить кольцо оргстекло руководство в камеру, рядом (С) фиксируют положение личинки с металлическим кольцом, и (D), близкий камеры. (E) Теперь камера готова для установки на микроскоп.

Рисунок 2
Рисунок 2 Body-стена мышц у личинок дрозофилы. Мышцы и NMJs были визуализированы выражение CD8-GFP-Ш гибридный белок 8. Мышцы показано как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинку. В (AC) самая поверхностная мышца, 27, Показано, в (KL) наиболее интерьера мышцы, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала Бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 2 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3 Идентичность тела стене мышц у личинок дрозофилы. Личность мышцы L3 дрозофилы личинки, сегмент A3, это показано на рисунке. Мышцы и NMJs были визуализированы выражение CD8-GFP-Ш гибридный белок 8. Мышцы отображаются как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинок. В переменного тока самое поверхностное мышц, 27, показано, в КЛ самых внутренних мышц, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 2 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4 Идентичность нервно-мышечных соединениях личинки дрозофилы. (AD) NMJs были визуализированы выражение DGluRIIA-mRFP гибридный белок 1. NMJs показаны как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинку. В (АВ) самый поверхностный NMJ, 27, Показано, в CD наиболее интерьера NMJs, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 5 мкм. (Е) и (F) идентичность поверхностных (E) и более интерьера (F) NMJs дается для справки.

Discussion

Представленный метод был первоначально разработан для изучения глутаматергической синапсы на стенки тела мышцы личинок дрозофилы. Дрозофилы нервно-мышечном соединении (NMJ) характеризуется стереотипными цито-архитектура мышц и нейронов и, таким образом, идеально подходит для обработки изображений естественных условиях. Тем не менее, описанные обезболивания протокол не ограничивается изображениями NMJ; прозрачность личинок дрозофилы облегчает адаптацию описанного протокола с целью изучения развития органов, миграция клеток, перевозки грузов и аксонального субклеточном реорганизации внутри клеток.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарим Андреаса Schönle, Макса-Планка-Института биофизической химии, Германии и Дэвид Дж. Сандстром, Национальный институт психического здоровья, Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Мэриленд, США за технической консультацией. Мы благодарим Фрэнка Kötting, Европейский Институт неврологии, Геттинген для построения изображения камеры и обезболивания устройства. Эта работа была поддержана грантами от болезни Альцгеймера Forschung инициативы по TMRYZ была поддержана общение Китай совета по стипендиям, SBH на общение Высшая школа для клеточной и молекулярной неврологии, Университет Тюбингена.

Materials

Reagents:

  • Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
  • Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
  • Fly culture medium

Equipment:

  • Inverted confocal microscope
  • Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
  • Small paintbrush as used to sort flies
  • Incubator
  • Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
  • Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
  2. Rasse, T. M. In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. Georg-August-University Göttingen. (1988).
  3. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
  4. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).
  5. Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. (2009).
  6. Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
  7. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  8. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &, Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats