चिपकने वाला टेप आधारित नमूनाकरण और प्रतिदीप्ति का संयोजन बगल में संकरण साल्मोनेला ताजा उपज पर

Immunology and Infection

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Summary

इस प्रोटोकॉल टमाटर और अन्य सतहों ताजा उपज के नमूने के लिए एक सरल चिपकने वाला टेप - आधारित दृष्टिकोण, तेजी से पूरे सेल का पता लगाने के द्वारा पीछा किया वर्णन

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Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce. J. Vis. Exp. (44), e2308, doi:10.3791/2308 (2010).

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Abstract

Protocol

1. बाँझ चिपकने वाला टेप के साथ भूतल नमूनाकरण

  1. नमूना लेने के लिए उपयोग करने के लिए टेप का चयन करें. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कवक टेप या कांग्रेस - चातुर्य यह नमूना टेप बाँझ और उपयोग में आसानी के लिए विशेष पैक कर रहे हैं. हालांकि, हमने पाया है कि पारदर्शी (ऑप्टिकली स्पष्ट) जेनेरिक कार्यालय टेप भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. गैर चिपचिपा एक 10 चिपकने वाला टेप के सेमी टुकड़ा (एक कागज टेम्पलेट इस्तेमाल किया जा सकता है) के पक्ष पर 1 सेमी 2 चौकों आकर्षित एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें. यह देखते हुए जो टेप के हिस्से को भोजन या पर्यावरण सतह नमूना प्रयोग किया गया है के लिए एक दृश्य गाइड के रूप में सेवा करेंगे.
  3. चिपचिपा सतह नमूना हो सामना करना पड़ पक्ष के साथ एक के आकार का "सी" टेप के पाश, फार्म. ऐसा करने के लिए, और टेप के (गैर चिपचिपा पक्ष) वापस (चित्रा 1) पर खींचा वर्ग के खिलाफ अंगूठे और मध्यम उंगली और तर्जनी स्थिति के साथ चिपचिपा छोर पकड़.
  4. जांचा जा सतह पर टेप प्लेस और धीरे सतह के खिलाफ चिह्नित क्षेत्र दबाएँ. बिना टेप के किनारों जारी, सूचकांक उंगली का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि टेप की चिपचिपा पक्ष नमूना की सतह के साथ पूर्ण संपर्क में आता है, बुलबुले से बचने.
  5. एक भी गति का प्रयोग, धीरे धीरे टेप नमूना से दूर खींच, शारीरिक रूप से सतह बाध्य रोगाणुओं निकालने. सेल चार्ज टेप, चिपचिपा पक्ष को एक गिलास माइक्रोस्कोप जेनेरिक पारदर्शी कार्यालय टेप का उपयोग कर स्लाइड पर बांधें. सुनिश्चित उचित / टेप के तनाव को खींच इतना है कि एक फ्लैट, गैर wrinkly सतह बनाई जाती है. यह विरूपण / संकरण के दौरान बाद में हीटिंग के दौरान टेप की कर्लिंग के साथ समस्याओं को कम करने में मदद करेगा.

2. ठोस चरण संवर्धन और तरल सतह Miniculture

  1. ठोस चरण संवर्धन चेहरा नीचे टेप सिलोज़ lysine-Tergitol (XLT 4) 4 अगर प्लेटों पर रखकर इतना है कि नमूना कोशिकाओं अगर सतह के साथ सीधे संपर्क में रखा जाता है के द्वारा किया जाता है. templated / नमूना टेप के संपर्क भाग रखा गया है अगर सतह और टेप के एक छोर के साथ फ्लश शिथिल पेट्री डिश की ओर दीवार का पालन संवर्धन निम्नलिखित अगर सतह से टेप की आसान हटाने की सुविधा है.
  2. प्लेट्स (कंडेनसेशन से बचने के लिए) औंधा कर रहे हैं और 35 में incubated - 37 डिग्री सेल्सियस साल्मोनेला एसपीपी की पर्याप्त वृद्धि की अनुमति के लिए. एक detectable स्तर कोशिकाओं समृद्ध की जरूरत ऊष्मायन अवधि की लंबाई प्रारंभिक साल्मोनेला संदूषण के स्तर पर निर्भर करेगा. हम कम प्रारंभिक inocula से 8 घंटे संवर्धन के बाद उत्कृष्ट microcolony गठन मनाया.
  3. वांछित संवर्धन अवधि के बाद, अगर प्लेट खुला. टेप ऊष्मायन के दौरान अपनी tackiness बनी रहेगी. धीरे अगर सूचकांक उंगली का उपयोग करने के लिए टेप अगर अंतरफलक पर गठित microcolonies की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के खिलाफ टेप दबाएँ. पेट्री डिश की दीवार से जुड़ी किनारे से टेप समझ और यह एक धीमी गति से, यहां तक ​​कि गति के साथ दूर. एक खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट सेल चार्ज टेप, चिपचिपा ऊपर की ओर, ऊपर 1.5 खंड में वर्णित के रूप में. "फिक्सेशन और निर्जलीकरण" नीचे कदम करने के लिए आगे बढ़ें.
  4. तरल सतह miniculture के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड पर नमूने के रूप में ऊपर अनुभाग 1.5 में वर्णित के लिए इस्तेमाल किया टेप बन्धन द्वारा शुरू करते हैं. अगले, templated / नमूना टेप की एक सिलिकॉन गैर बाँझ छिड़काव कक्ष (Coverwell, अनुग्रह जैव - लैब्स, Inc) के साथ संपर्क भाग, जिसका नीचे सेल चार्ज टेप शामिल हैं, ऊपर का सामना करना पड़ रहा है एक सीलबंद कक्ष के गठन को कवर. मजबूती है, लेकिन धीरे जगह में कक्ष एक निर्विवाद मुहर सुनिश्चित दबाएँ.
  5. एक लचीला पिपेट टिप, हस्तांतरण 500 ≤ μL Trypticase सोया शोरबा या अन्य कक्ष छोटे इनलेट बंदरगाहों के माध्यम से उपयुक्त संवर्धन माध्यम लोड हो रहा है जेल का उपयोग. 35 -37 पर वाष्पीकरण और सेते स्लाइड्स को रोकने के लिए पारदर्शी कार्यालय टेप के साथ दोनों बंदरगाहों का सील डिग्री सेल्सियस के रूप में पर्याप्त संवर्धन के लिए आवश्यक है. हालांकि सभी आपरेशनों अच्छा नमूना और हैंडलिंग प्रथाओं के अनुसार किया जाना चाहिए, बंदरगाह सील टेप या छिड़काव कक्षों के बाँझपन तरल सतह miniculture के दौरान की आवश्यकता नहीं है. मछली और प्रवाह cytometry के संयोजन साल्मोनेला एसपीपी के स्पष्ट भेदभाव सक्षम हो जाएगा. गैर लक्ष्य बैक्टीरिया है कि वर्तमान गैर लक्ष्य वनस्पति नमूना से ही आने की उम्मीद का सबसे बड़ा योगदान के साथ, हो सकता है. "फिक्सेशन और निर्जलीकरण" नीचे कदम करने के लिए आगे बढ़ें.

3. फिक्सेशन और निर्जलीकरण

  1. प्रत्यक्ष सतह के नमूने लिए या साल्मोनेला एसपीपी के ठोस चरण संवर्धन के लिए. अगर XLT 4-पर, 25 में 30 मिनट के लिए टेप पर सेल निर्धारण प्रदर्शन ° सी 500 μL 10% तटस्थ के साथ नमूना संपर्क क्षेत्र को कवर द्वारा formalin buffered.
  2. एक sealable कंटेनर (एक रासायनिक परेशान / विषाक्त वाष्प के लिए जोखिम को कम करने के हुड के नीचे) में लगानेवाला त्यागें.
  3. एक इथेनॉल श्रृंखला (μL 300 / 3 मिनट प्रत्येक एकाग्रता 50%, 80% और 95%) में निर्जलीकरण. "संकरण" नीचे कदम करने के लिए आगे बढ़ें.
  4. 500 μL तरल सतह miniculture नमूना के निर्धारण के लिएछिड़काव कक्षों unsealed, कर रहे हैं और एक लचीला जेल लोडिंग विंदुक टिप enrichate निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है. रैपिड और नीचे pipetting किसी भी शेष टेप बाध्य कोशिकाओं के प्रभावी हटाने सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  5. अगला, पूरे 500 μL miniculture मात्रा एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरित किया है और २००० XG (5 मिनट) पर नीचे घूमती है. सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है, गोली सख्ती के लिए 30-60 एस vortexed है, तो 10% के बराबर मात्रा में resuspended तटस्थ formalin buffered. कक्ष 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर तय कर रहे हैं
  6. अगला लगानेवाला निकाल दिया है और नमूना सेल का भंडारण बफर में resuspended है, इस प्रकार है. एस 60, 50% गैर विकृत इथेनॉल 50% के एक बराबर मात्रा में resuspended फॉस्फेट - नमूना नीचे 2000 XG (5 मिनट, 25 ° सी) सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है, गोली सख्ती 30 के लिए vortexed है पर घूमती है खारा बफर. फिक्स्ड कोशिकाओं को अनिश्चित काल के संग्रहीत किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस (वर्ष) नोट: जब भी तरल पदार्थ (उदाहरण के लिए, जब एक बंधक या अलग बफर शुरू) बदल रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से (vortexing) के साथ एक न्यूनतम हिस्से में सेल (~ 10 - 20 μL) गोली resuspend "निवर्तमान" तरल प्रणाली के . यह clumping को रोकने के लिए और सुनिश्चित करें कि व्यक्ति की कोशिकाओं के भी निलंबन को प्राप्त कर रहे हैं करने में मदद करेगा. "संकरण" नीचे कदम करने के लिए आगे बढ़ें.

4. वर्ण - संकर करना

  1. संकरण / धोने बफर तैयार वाणिज्यिक आणविक जीव विज्ञान ग्रेड सामग्री तालिका में उल्लेख किया समाधान का उपयोग. अंतिम बफर घटक सांद्रता 0.7 एम NaCl, 0.1 एम Tris [पीएच 8.0], 10 मिमी EDTA हैं 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट, अंतिम वांछित मात्रा के लिए आणविक ग्रेड पानी और फ़िल्टर्ड 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज या कप फिल्टर का उपयोग के साथ बनाया. जांच के अलावा (नीचे देखें) के बिना एक ही बफर, एक कपड़े धोने बफर के रूप में प्रयोग किया जाता है. पहले से गरम संकरण और 55 से बफ़र्स धोने डिग्री सेल्सियस
  2. Fluorescently लेबल जोड़ें Sal3 (Nordentoft एट अल, 1997; 5'-AAT सीएसी टीटीसी एसीसी GTG-3 टीएसी ') और (Salm 63 Kutter एट अल, 2006; 5'-TCG अधिनियम GAC टीटीसी AGC टीसीसी-3' ) preheated संकरण बफर करने के लिए oligonucleotide जांच (सामग्री तालिका). 5 एनजी μL -1 की कुल जांच एकाग्रता (; Bisha और Brehm-Stecher, 2009a 2.5 एनजी μL -1 प्रत्येक जांच जैसे) प्रयोग किया जाता है.
  3. प्रत्यक्ष-to-टेप और ठोस चरण संवर्धन के नमूने लिए, संकरण जांच कॉकटेल युक्त बफर के 300 μL के साथ टेप के templated नमूना संपर्क क्षेत्र उपरिशायी और एक नम, सील ऊष्मायन 55 सी. सेंटीग्रेड सेट चैम्बर में टेप बाध्य कोशिकाओं संकरण यदि एक सीधा संपर्क इनक्यूबेटर स्लाइड खाई साधन (सामग्री तालिका) जैसे प्रयोग किया जाता है, नमूने 15 मिनट के लिए संकरित हैं और> 20 स्लाइड्स के साथ संसाधित किया जा सकता है. यदि एक रोटरी शैली जैसे Bambino साधन (सामग्री तालिका) संकरण ओवन प्रयोग किया जाता है, स्लाइड संकरण के लिए 50 एमएल polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब, ट्यूब प्रति एक स्लाइड में रखा जाता है. क्योंकि गर्मी हस्तांतरण प्रत्यक्ष नहीं है, इन नमूनों लंबी अवधि (30 मिनट) के लिए संकरित हैं.
  4. संकरण के बाद, स्लाइड हटा रहे हैं और जांच युक्त संकरण बफर उपरिशायी खारिज कर दिया है. स्लाइड्स तो या तो preheated धोने बफर के एक उपरिशायी या के साथ या तो संक्षेप में और धीरे से झुका स्लाइड (300 μL प्रत्येक की 3 rinses) पर बफर की एक छोटी मात्रा pipetting द्वारा preheated धोने बफर के साथ rinsed, या औपचारिक रूप से धोया (30 मिनट) 50 एमएल polypropylene अपकेंद्रित्र preheated धोने बफर युक्त ट्यूब में विसर्जन. हमारे अनुभव में, हालांकि एक औपचारिक धोने के बेहतर परिणाम (कम अनबाउंड जांच से धुन्ध) प्रदान करेगा, एक सरल कुल्ला साल्मोनेला एसपीपी का स्पष्ट पता लगाने के लिए पर्याप्त है. अगला, स्लाइड हवा "जांच" कदम के लिए नीचे जाने से पहले सूखे हैं.
  5. तरल सतह miniculture के नमूनों के संकरण नीचे 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए नमूने कताई (हौसले निश्चित या भंडारण बफर में -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा) द्वारा किया जाता है, गोली के जोरदार vortexing और 100 μL preheated संकरण युक्त बफर में resuspension द्वारा बाद जांच कॉकटेल. नमूने 55 में संकरित हैं ° सी गर्मी ब्लॉक या अन्य उपयुक्त ऊष्मायन स्टेशन (सामग्री तालिका), 500 μL preheated धोने बफर के अलावा द्वारा पीछा किया पर 30 मिनट के लिए. टेप बाध्य नमूनों के साथ के रूप में, इन नमूनों को औपचारिक रूप से के लिए धोया हो सकता है अप करने के लिए 55 में 30 मिनट ऊष्मायन के साथ आगे ° सी में आंतरायिक vortexing के साथ इस धोने बफर, वैकल्पिक रूप से, नमूने को अच्छी तरह से 500 μL preheated धोने बफर के अलावा के बाद vortexed हो सकता है, विश्लेषण के लिए तत्काल कटाई (नीचे) के द्वारा पीछा किया.
  6. साल्मोनेला एसपीपी का पता लगाने के के लिए तैयार करने में. cytometry प्रवाह के माध्यम से तरल सतह miniculture के नमूनों नीचे 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर घूमती हैं, सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है और नमूने 300 μL कमरे के तापमान में resuspended हैं (~ 25 डिग्री सेल्सियस) PBS. यदि नमूने एक दूर की सुविधा के लिए परिवहन की आवश्यकता होती है, या यदि संकरण और विश्लेषण के बीच एक देरी की उम्मीद है, नमूने प्रशीतित या बर्फ पर आयोजित एना के लिए पहले किया जा सकता हैlysis. वैकल्पिक रूप से, नमूने सेल का भंडारण बफर (पीबीएस और निरपेक्ष इथेनॉल के 50:50 मिश्रण) के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है और -20 ° सी में आयोजित में प्रशंसनीय नुकसान के बिना एक सप्ताह तक के लिए जांच - प्रदत्त प्रतिदीप्ति (Bisha और Brehm-Stecher, 2009b) .

5. खोज

  1. साल्मोनेला एसपीपी का पता लगाने पर टेप के लिए . प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से, प्रत्यक्ष-to-टेप या ठोस चरण संवर्धन नमूनों ~ 10 μL Vectashield एच 1200 बढ़ते परमाणु 4 counterstain युक्त मध्यम ',6-diamidino-2 - phenylindole (DAPI), एक कवर पर्ची के साथ घुड़सवार के साथ overlayed कर रहे हैं, फिर 10 मिनट के लिए अंधेरे में incubated.
  2. विसर्जन तेल कवर पर्ची पर रखा है, और नमूने एक तेल उच्च बढ़ाई उद्देश्य (63x या 100x) का उपयोग कर जांच कर रहे हैं. DAPI फिल्टर के ध्यान में नमूना लाने के लिए प्रयोग किया जाता है, माइक्रोस्कोप तो उपयुक्त (हरे या लाल, अंत लेबल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया डाई पर निर्भर करता है) फ़िल्टर और साल्मोनेला कोशिकाओं के लिए बंद है नेत्रहीन उनके प्रतिदीप्ति के अनुसार (रन बनाए हैं आंकड़े 2 और 3).
  3. तरल सतह miniculture के नमूनों की cytometric पता लगाने के लिए विभिन्न उपकरणों स्थानीय उपलब्धता के आधार पर हो सकता है, किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में, Pbs निलंबित नमूने 5 एमएल दौर नीचे नमूने ट्यूब (बी फाल्कन) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और 647 एनएम (सामग्री तालिका) में उत्तेजना के साथ एक FACSCanto प्रवाह cytometer का उपयोग की जांच. समृद्ध कुल जीवाणुओं की उच्च संख्या वाले नमूने के लिए, "कम प्रवाह दर" सेटिंग (10 μL मिनट -1) और प्रयोग किया जाता है और 5,000-50,000 घटनाओं एकत्र कर रहे हैं . डेटा FlowJo सॉफ्टवेयर (संस्करण 8.8.6, स्टार ट्री, इंक, Ashland, या) या अन्य उपयुक्त विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 4, पैनल ए और बी) का उपयोग करते हुए विश्लेषण कर रहे हैं.

6. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. साल्मोनेला एसपीपी के नमूने के लिए चिपकने वाला टेप का प्रयोग करें . एक कृत्रिम रूप से दूषित टमाटर की सतह से.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रत्यक्ष करने के लिए टेप का नमूना और एक टमाटर (100 एक्स तेल का उद्देश्य) की सतह से साल्मोनेला के ATCC 14028 मछली का पता लगाने के लिए विशिष्ट परिणामों के दो जांच टेक्सास के एक कॉकटेल रेड लेबल जांच ( Sal3/Salm-63) का इस्तेमाल किया गया था इन कोशिकाओं को लेबल करने के लिए.

चित्रा 3
चित्रा 3. साल्मोनेला 14028 ATCC के Microcolonies 37 में एक 8 घंटे और संवर्धन पर टेप डिग्री सेल्सियस के बाद प्रारंभिक inoculum एक कृत्रिम रूप से दूषित टमाटर की सतह से नमूना था सिलोज़ Lysine Tergitol 4 (XLT 4) अगर की सतह पर गठित हैं. ठोस चरण संवर्धन पता लगाने के लिए उपलब्ध है कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है और यह भी सेलुलर rRNA सामग्री को बढ़ाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. एस के नमूने के लिए चिपकने वाला टेप का प्रयोग enterica serovar typhimurium के रूप में एक कृत्रिम रूप से दूषित टमाटर, मछली और प्रवाह cytometry (पैनल ए) के माध्यम से या प्रत्यक्ष विश्लेषण द्वारा 5 गैर चयनात्मक घंटे एक छिड़काव 500 μL Trypticase सोया शोरबा (पैनल बी से भरा कक्ष में तरल सतह miniculture संवर्धन के बाद की सतह से ).

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Discussion

उत्पादन सतहों पर रोगज़नक़ों का पता लगाने के लिए सरल और तेजी से तरीकों में मदद मिल सकती है समय पर और कार्रवाई डेटा उपलब्ध कराने के द्वारा foodborne रोग को कम करने के. 1950 के बाद से चिपकने वाला टेप आधारित नमूने तरीकों किया गया है, पर्यावरण, नैदानिक ​​और खाद्य सूक्ष्म जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है और सतहों के लिए शैली "स्कॉच" टेप के सूक्ष्मजीवों के हटाने के लिए, दबाव प्रत्यक्ष सूक्ष्म परीक्षा या पक्षपाती सूक्ष्मजीवों के लिए ठोस मीडिया हस्तांतरण द्वारा पीछा शामिल विकास (Barnetson और Milne, 1973; एडवर्ड्स एंड Hartman, 1952; Evancho एट अल, 2001, फंग एट अल, 1980; लक्ष्मणन और Schaffner, 2005; Langvad, 1980). हाल ही में एक संशोधन स्वस्थानी संकरण (मछली) में पत्थर स्मारकों (ला Cono और सी. Urzì, 2003) की सतहों बस्तियां सूक्ष्मजीवों की संस्कृति स्वतंत्र विश्लेषण के लिए प्रतिदीप्ति साथ टेप आधारित नमूने के संयोजन का वर्णन किया. हम तेजी से नमूना और ताजा उपज, टमाटर, पालक, और jalapeno मिर्च (Bisha और Brehm-Stecher, 2009a) सहित पर मौजूद साल्मोनेला का पता लगाने के लिए एक समान दृष्टिकोण लागू है. चिपकने वाला टेप करने के लिए इन खाद्य पदार्थों और नमूनों से कोशिकाओं को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तो मछली के लिए संसाधित किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा. एच. 2 - इस तरह के रूप में कुछ के रूप में 10 3 CFU सेमी -2 साल्मोनेला (माइक्रोस्कोपी आधारित तरीकों के लिए पता लगाने की सीमा) 1.5 ~ भीतर ताजा उपज पर पता लगाया जा सकता है वैकल्पिक रूप से, छोटी (8 घंटे) ठोस चरण संवर्धन के नीचे सेल चार्ज टेप चेहरे चयनात्मक अगर पर रखकर प्रदर्शन किया जा सकता है है, और जिसके परिणामस्वरूप microcolonies मछली द्वारा पता लगाया. ≤ 500 μL तरल मीडिया के साथ टेप overlaying द्वारा, टेप नमूना साल्मोनेला कोशिकाओं और अलग किया जा सकता cytometry प्रवाह का उपयोग कर मछली के बाद सीधे का पता चला (4 चित्रा, एक पैनल). इन गैर चयनात्मक तरल minicultures का संक्षिप्त ऊष्मायन (~ 5 घंटे) साल्मोनेला आसानी से मछली के बाद लक्ष्य और गैर लक्ष्य कोशिकाओं (चित्रा 4, पैनल बी) के जटिल मिश्रण में पाया कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया की पर्याप्त संवर्धन की अनुमति देता है . सामूहिक रूप से, हमारे परिणाम दिखाना है कि इस दृष्टिकोण निष्कर्षण, प्रस्तुति, और टमाटर और अन्य ताजा उपज पर उपस्थित विशिष्ट जीवाणुओं की पहचान के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है. यद्यपि हम यहाँ डीएनए आधारित जांच का उपयोग वर्णन किया है, यह संभावना है कि इस दृष्टिकोण भी वैकल्पिक जांच chemistries जैसे पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (PNAS), (अल्मीडा जिसके लिए साल्मोनेला विशेष जांच भी वर्णित किया गया है को शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है अल एट, 2010).

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के लिए अनुदान एक विकसित आयोवा मान कोष BFBS पुरस्कार द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungi-Tape sampling tape Scientific Device Laboratory 745 http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape Birko Corporation, Denver, CO http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic Various Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface Local Grocery Store Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth Difco Laboratories 211768 For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base Difco Laboratories 223420 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement Difco Laboratories 235310 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011 10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023 Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes Various RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution Sigma-Aldrich S5150 Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) Sigma-Aldrich T9285 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution Sigma-Aldrich L4522 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes Integrated DNA Technologies 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge Various Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber Grace Bio-Lab Inc. PC1R-2.0 Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) Thermo Fisher Scientific, Inc. 05-408-151 Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station Various Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven Boekel Scientific Model 230300 Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer Boekel Scientific Model 240000 Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200 Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope Various Leitz Laborlux S used here
Digital camera Various Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software Various Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop Adobe For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer Various FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software Various FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used

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References

  1. Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).
  2. Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. Skin sampling for Candida with adhesive tape. Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).
  3. Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.
  4. Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system. Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).
  5. Edwards, R. W., Hartman, E. A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces. Lloydia. 15, 39-39 (1952).
  6. Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F. Microbiological monitoring of the food processing environment. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Pouch Downes, F., Ito, K. 4th edition, American Public Health Association. Washington, D.C. (2001).
  7. Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces. J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).
  8. Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).
  9. La Cono, V., Urz, C. Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips. J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).
  10. Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations. Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).
  11. Langvad, F. A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves. Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).
  12. Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).

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