Kan Bazlı Makrofaj Taşıma Nanoformulated antiretroviral ilaçlar Geliştirme Yöntemleri

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

Indinavir, ritonavir, efavirenz ve atazanavir Nanopartiküller ıslak öğütme, homojenizasyon ve ultrasonik kullanılarak imal edildi. Bu nanoformulations, toplu nanoformulated makrofaj tabanlı ilaç dağıtım değerlendirildi antiretroviral tedavi (nanoART) olarak adlandırılır. Monosit türevi makrofaj nanoART alımı, saklama ve sürekli salım belirlendi. Bu ön çalışmalar, klinik kullanım için nanoART potansiyel öneririz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Balkundi, S., Nowacek, A. S., Roy, U., Martinez-Skinner, A., McMillan, J., Gendelman, H. E. Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs. J. Vis. Exp. (46), e2460, doi:10.3791/2460 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antiretroviral (ART) ilaçlar için ilaç toksisiteleri azaltmak için de hizmet verirken Nanoformulated ilaçların farmakodinamik ve biyoyararlanımını artırabilir. Bu amaçla, bizim laboratuar ART rejimleri basitleştirmek için nanotıp, ilkeleri uygulanır ve uyum ve ilaç farmakokinetiği artırırken gibi toksisiteleri azaltmak. Üretim nanoformulated ART (nanoART) için basit ve güvenilir bir yöntem gösterilmiştir. Saf ilaç parçacıkları surfaktan lipid kaplama ince bir tabaka ile sarmalanır ve ıslak öğütme veya yüksek basınçlı homojenizasyon küçük olanları içine büyük ilaç kristalleri fraksiyonasyon tarafından üretilmektedir. Alternatif bir yöntem serbest ilacın bir polimer bir damlacık askıya alınır. Burada, ilaç bireysel nano boyuttaki damlacıkları oluşana kadar sonra ultrasonik çalkalanırken bir polimer içinde çözülür. Dinamik ışık saçılımı ve mikroskobik muayene parçacıklar (partikül boyutu, şarj ve şekli) fiziksel özelliklerini karakterize eder. Onların biyolojik özellikleri (hücre alımı ve tutma, sitotoksisite ve antiretroviral etkinliği) insan monosit kökenli makrofajlar (MDM) ile belirlenir. MDM, arıtma için santrifüj Yıkayarak tasviye kullanarak leukopacks izole edilmiş insan periferik kan monositler türetilmiştir. Bu tür kan kaynaklı makrofajlar nanoART dağıtım insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfekte organların hücresel taşıyıcılar olarak kullanılıyor olabilir. Biz bağ, klinik kullanıma antiretroviral ilaçları, HIV-1 tedaviler için nanopartiküller içine ambalajladığını uyumu geliştirmek ve hastalık sonuçları olumlu etkileyebilir.

Protocol

NanoART üretim

1. Islak freze NanoART NETZSCH MicroCer Yöntemleri

  1. Analitik bir denge kullanarak nanoformulations ve 10 mM HEPES tamponu, pH 7.8 T-18 Ultraturrax mikser kullanarak tamamen dağılana kadar karıştırın kullanılacak olan ilaç kristalleri ve çeşitli yüzey tartılır. % 2 - formülasyonu ilaç yüzde 1 arasında olmalıdır.
  2. Sürekli freze, soğutucu ve kompresör açık olduğundan emin olun. Değirmen numunenin başlamadan önce çıkış basıncı 100 PSI civarında olmalıdır.
  3. Kontrol ünitesi açma ve taşlama medya tank yüklü olması, böylece taşlama tankı döndürmek.
  4. Bir huni kullanarak taşlama odasına boncuk 50 ml ekleyin. Mekanik salmastra sızıntılarını önlemek için hiçbir boncuk taşlama odasının dışında konuları veya herhangi bir yerde olmadığından emin olun.
  5. O-ring freze odasının yerini olduğundan emin olun. Uygun bir ekran hasır boyutunu seçin ve uygun kapak montaj ve somunları sıkarak kapakları güvenli. Ekran mesh boyutu en az yarım boncuk boyutta olması gerekir. Ürünün sürekli öğütme sırasında filtrenin tıkanmasını önlemek için, büyük ekran örgü boyutu kullanın.
  6. Öğütme haznesi Alt odasının üstünde sağlanan düğmeyi kullanarak yatay ve emin olmak için toplama kabına ürün çıkış borusunun boşaltır.
  7. Ürün girişine yüzey çeşitli miktarlarda uyuşturucu süspansiyonu ekleyin. Süspansiyonun minimum hacim 100 mL olmalıdır. Bu aşırı ısınmasını önlemek ve Tambur parçalar üzerinde daha az aşınma nedeniyle boncuk kontaminasyonu önlemek
  8. Pompa kontrol ünitesi kullanarak başlayın. Akış hızı formülasyonu (~ 50 - 150 ml / dk) için gerekli olan çeşitli olabilir.
  9. Karıştırıcı açın ve kontrol ünitesi hızını ayarlayabilirsiniz. Bir MicroCer 620 rpm 4320 rpm hızı artırılabilir. Sıcaklık üst öğütme odasına bağlı ve herhangi bir aşırı ısınma olduğundan emin olun sıcaklık ölçer kullanarak izleyin.
  10. Çeşitli hızlarda ve akış hızlarında Mill örnek ve küçük boyutu ve şarj Kırınım Işık Saçılma Brookhaven Zetasizer (Tablo 1) kullanılarak ölçümler için formülasyonun alikotları (~ 1 ml).
  11. Istediğiniz boyutu elde edildikten sonra, kontrol ünitesi kullanılarak freze durdurun. Hala pompa ile örnek bir balona toplamak. Ilacın tamamen örnek toplama şişesi içine akmasını sağlayın.
  12. Pompa kapatın. Boncuklar kaldırmak için, ünitenin altına bir toplama kabı yerleştirin. Ön kapak montaj plakası üzerinde somunları ve boncuk tepsi toplamak. Ön plaka çıkartın ve tepsiye boncuk yıkamak için deiyonize su şişesi kullanın.
  13. 50 ml santrifüj tüpleri içine öğütülmüş süspansiyon transferi ve 10.000 rpm (10.174 RCF) 30 dakika boyunca santrifüj. Santrifüj döngüsünün tamamlanmasından sonra, süpernatant miktarını ölçmek ve aynı miktarda taze sürfaktan çözüm ile değiştirin.
  14. Tabanda tamamlandıktan sonra, freze odası ve 10 dakika için değirmen süspansiyon aktarın. Bir kısım (~ 1 ml) alın ve Zetasizer (Tablo 1) kullanarak tekrar numune boyutu ve şarj ölçmek.
  15. Deiyonize su ve% 70 etanol kullanarak MicroCer bir kullanım sonrası temizlik yapın.
  16. HPLC cihazı kullanılarak nanoART formülasyonları konsantrasyonunu ölçün. Bizim durumumuzda, tarafından gönderilen numunelerin C8 koruma kartuşu ile YMC Oktil C8 kolon (Waters A.Ş., Milford, MA) üzerine üç nüsha 20 mcL enjeksiyonları kullanarak ters faz HPLC ile değerlendirdi. % 48 asetonitril /% 52 25mm KH 2 PO 4, pH 4.15 oluşan Mobil faz, 0.4 ml / dak 'da 272 nm dalga boyunda UV / Vis algılama pompalanır. Tüm ilaç ölçümleri için, kantitatif metanol hazırlanan her ücretsiz ilaç (,025-100 mcg / mL) standart bir eğrisine göre belirlenir.

2. Avestin EmulsiFlex C5 kullanarak NanoART Homojenizasyon

  1. Analitik bir denge kullanarak nanoformulations ve 10 mM HEPES tamponu, pH 7.8 tam dispersiyon elde etmek için T-18 Ultraturrax mikser kullanarak onları karıştırmak için kullanılacak olan ilaç kristalleri ve çeşitli yüzey ölçün.
  2. Süspansiyon homojenleştirici gemi transferi ve devridaim başlar. Soğutucu önce numune homojenize başlayan açık olduğundan emin olun.
  3. Metre 20.000 ± 2.000 psi okur ve hedef parçacık boyutu elde edilene kadar devam homojenize kadar kademeli basınç artırın. 60 dakika - Bu genellikle 45 arasında sürer. Periyodik olarak bir kısım (~ 1 ml) alın ve bir Zetasizer (Tablo 1) kullanarak örnek boyutu ve şarj ölçmek.
  4. Homojenizatör homojenize edilmiş süspansiyon, 50 ml santrifüj tüplerine transferi ve 10.000 rpm (10.174 RCF) 30 dakika boyunca santrifüj. Tamamlanmasının ardındansantrifüj döngüsü, süpernatant miktarını ölçmek ve taze sürfaktan çözümün eşit hacmi ile değiştirin.
  5. Tabanda sonra, C5 homojenizatör süspansiyon aktarın. Dolaşımını yeniden başlatın ve 20.000 ± 2.000 psi homojenizasyon basıncı dönmek ve 30 dakika süreyle homojenize. Zetasizer (Tablo 1) kullanılarak formülasyonu boyutu ve şarj ölçün.
  6. Deiyonize su ve çözücü olarak etanol ile birim sonrası temizlik yapın.
  7. HPLC cihazı kullanılarak örneklerin konsantrasyonu ölçün.

3. Cole Parmer Ultrasonik İşlemci kullanarak Sonikasyon

  1. Diklorometan bir cam behere 50 ml ölçün. Analitik terazi ile poli Tedbir 6 g (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), tam bir çözülme görülmektedir kadar diklorometan ekleyin ve karıştırın.
  2. 1,25 g ilaç kristalleri ölçün ve diklorometan / PLGA çözüm ekleyin. Tam çözülme elde etmek için karıştırın.
  3. % 1 polivinil alkol (PVA) sürfaktan çözüm olun ve bir buz banyosunda kullanarak serin. Sürfaktan çözüm, çözünmüş ilaç içeren organik çözüm eklenmesinden önce serin olduğundan emin olun.
  4. % 1 PVA sürfaktan çözüm içine ilaç çözüm dökün ve% 50 genlik ultrasonicator başlatmak. Sürfaktan çözüm, bir buz banyosunda yerleştirildiğinden emin olun. ~ Örnekleri küçük partiler için% 30 genlik sonikatör genliği düşebilir. 10 dakika boyunca örnek sonikasyon.
  5. (~ 1 ml), partikül boyut analizi (Tablo 1) için küçük bir kısım dışarı atın. Parçacıkların büyüklüğü 1.5 mm daha fazla ise, en fazla toplam 16 dakika kadar 2 dakika aralıklarla numune sonikasyon. 20x ve belge gözlemlerini (Şekil 1A) mikroskop altında örnekleri dikkate alınmalıdır.
  6. Kalan süspansiyon için yeterli bir girdap oluşturmak ve oda sıcaklığında bir gece karıştırmaya devam heyecan tabak kullanın.
  7. 8 g mannitol bir balona tartılır ve 80 ml RO su ekleyin. Tam bir çözülme görülmektedir kadar karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın. Örnekleri liyofilize gerekiyorsa santrifüj sonra tabanda için kullanılacaktır.
  8. 24 saat sonra süspansiyon toplayın ve 50 ml santrifüj tüplerine dökün. 5, 20 dakika boyunca 8.000 rpm hızında örnekleri Santrifüj ° C Filtreli ters osmoz (RO) su ve 75 ml% 0.5 cetyl trimethylammonium bromür (STAB) sürfaktan diğer yarısı 75 mL supernatant ve tekrar süspansiyon yarısı örnek Durusu.
  9. 5 ° C'de 20 dakika 8000 rpm hızında numuneleri tekrar santrifüj ve toplam 20 ml mannitol çözüm her pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
  10. Ikinci tabanda sonra, (Tablo 1) Zetasizer kullanılarak partiküllerin boyutunu ölçmek.
  11. Kalan süspansiyon aktarmak ve onları lyophilizer içine yerleştirmek için uygun şişeleri kullanın.
  12. HPLC cihazı kullanılarak örneklerin konsantrasyonu ölçün.

4. NanoART Morfoloji

  1. NanoART süspansiyon ve kısaca sonication probu ile 5 saniye boyunca% 20 genlik az sonikasyon. 1.7 mL mikrosantrifüj tüp ve 10 saniye vorteks içinde RO su içine 1.5 ml süspansiyon 10 mcL aktarın.
  2. 50 mcL su nanoART çözüm ve 0.2 mikron polikarbonat filtrasyon membran (Nuclepore Parça-Etched) ile birleştirilmiş bir Swinnex 13 polipropilen filtre tutucu oluşan bir filtrasyon aparatı transferi bir örnek ele alalım. Filtrasyon aparatı 50 mcL 0.2μm önce seyreltilmiş ilaç süspansiyon ek distile su filtre ile astarlanmalıdır. Tüm çözüm hacmi tamamen filtrasyon membran geçmiş çekilir kadar Vakum aparatı uygulanır.
  3. Membran kuruduktan sonra, çift sopa iletken karbon bant kullanarak bir alüminyum pin saplama yapıştırılmış ve paladyum ile kaplanmıştır sputter. Numune saplama sonra bizim durumumuzda, bir JEOL JSM6300F alçak gerilim, saha emisyon taramalı elektron mikroskobu (Şekil 2) kullanarak görüntülü.

5. NanoART Görselleştirme

  1. Hazırlanan nanoART süspansiyonlar ve sonication probu ile% 20 genlik az 10 saniye süreyle sonikasyon.
  2. Kayma ve ters bir mikroskop bir mikroskop lamı kapağı atın. Kapak kayma fosfat 100 mcL nanoART süspansiyon 15 mcL tamponlu salin (PBS) ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme karışım karıştırın. 20x objektif (Şekil 3) kullanarak nanopartiküller gözünüzde canlandırın.

NanoART, Biyolojisi

6. Kan Borne, Monosit ve monosit-türevli Makrofajlar (MDM), izolasyonu ve Hazırlık

  1. HIV-1 ve hepatit seronegatif donörlerin leukapheresis insan monositler edinin ve akıntıya karşı santrifüj Yıkayarak tasviye hücreleri arındırmak. Anti-CD68 (klon KP immunolabeling hücre saflık değerlendirinWright-lekeli cytospins 1 -1).
  2. DMEM Kültür saflaştırılmış monositler 1x10 bir konsantrasyon% 10 ısı inaktive toplanmış insan serumu,% 1 glutamin, 50 mg / ml gentamisin, 10 mcg / ml siprofloksasin ve 1000 U / ml rekombinant insan makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) ile takviye 37 6 hücre / ml ° C,% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde. Amacıyla 7 gün 6 kuyucuğu ve kültür hücreleri de başına Levha 2x10 6 hücre monositler makrofaj 1 ayırt etmek için izin vermek. (Şekil 3A)

7. Hücre Alımı ve Toplama

  1. Nihai konsantrasyonu 100 mcM nanoART (MCSF olmadan) kültür medya ile karıştırın ve her iyi tedavi orta 1 ml ekleyin.
  2. İstediğiniz zaman gelin, ya da hücreler tam nanoART (Şekil 2) yüklü olan tüm tedavi aracı kaldırmak ve hücreleri tarafından alınmamıştır herhangi bir parçacıkları çıkarmak için 1 ml PBS ile hücreleri 3 kere yıkayın. 1 mL PBS kuyunun dibinden, bir hücre kaldırıcı ile yapışık hücrelere kaldırmak ve 1.7 mL mikrosantrifüj tüp 2-4 içine yerleştirin.
  3. 4 1.000 RCF hücreler Santrifüj ° C'de 10 dakika. Süpernatantı ve% 100 metanol 200 mcL ekleyin. Hücrelerin Lyse ve% 20 genlikte pelet sonicating sonicating probu ile (2-5 saniye) kısa bir süre nanoART çözülür. -80 Yılında Mağaza örnekleri ° C ilaç içeriğini analiz etmek için hazır olana kadar.

8. NanoART, intrasellüler Tutma

  1. MDM 7.1 'de açıklandığı gibi davranın.
  2. 7.2 'de açıklandığı gibi hücrelere istenilen zaman noktada, yıkayın, ancak hücreleri derhal kadar kazıma yerine, 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4)% 3 glutaraldehid bir çözüm oda sıcaklığında 15 dakika hücreleri gidermek ve bunları düzeltmek için 10 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4)% 1 osmiyum tetroksit dakika.
  3. 7.2 'de açıklandığı gibi 1 mL PBS içinde fiksatif ve kazıma hücreleri çıkarın. Ayrıca, toplamak ve 7.2 'de tarif olarak hücreler santrifüj; ama yerine pelet metanol ekleyerek, glutaraldehit fiksatif çözüm 200 mcL ekleyin.
  4. Mikrotom ile ince (80 nm) bölüme hücre pelletini kesin. Uranil asetat ve kurşun sitrat ile bölümleri Leke. Transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 4) ile boyanan kesitler dikkate alınmalıdır.

9 - ART Yayın

  1. 7,1-7,2 de açıklandığı gibi hücreleri davranın; Ancak, yıkandıktan sonra hücreleri toplamak yerine, MCSF olmadan ve nanoART olmadan 2 mL hücre kültür ortamı ile PBS yerine.
  2. Belirtilen gün, ya da orta sarı, döviz yarım dönüm hücre kültür ortamı ile gösterilir.
  3. Istenilen gün 7.2-7.3 açıklanan çoğaltmak hücreleri ile birlikte hücre orta 1 mL toplamak.
  4. Süreç hücreleri gibi 7.3 'de açıklanmıştır. Süreç, 10 saniye süreyle tam hız% 100 metanol ve vorteks 1 mL 150 mcL orta örnek ekleyerek orta. Ardından 10 dakika boyunca 21.000 RCF örnekleri santrifüj. Süpernatantı ve yeni bir tüpe transfer. Bir vakum santrifüj metanol buharlaşması, bu örnek bağlı olarak 1 ila 4 saat kadar sürebilir. Numuneler -80 ° C ilaç analizi için hazır olana kadar saklayın.

10 Konfokal Mikroskop NanoART Gerçek-zamanlı Alımı

  1. Vybrant Hücre Etiketleme Çözümü üretimi talimatı aşağıdaki gibi bir hücre etiketleme çözümü kullanarak hücrelerin adım 6.2 ve etiket olgun MDM alın. Hücrelerin herhangi bir aşırı boya kaldırmak için 1 ml kültür ortamı kullanılarak 3 kez durulayın.
  2. NanoART floresan etiketli nanoART 7.1 kullanarak adım gibi kültür ortamı ile karıştırın.
  3. Konfokal bir mikroskop ile görüntüleme hemen önce etiketli nanoART ile tedavi orta ekleyin. 60x hedefi 5 (Video 1 ve 2) ile 4 saat boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayabilirsiniz.

HIV-1 enfeksiyon ve enfektivite Tahliller

11. HIV-1 ADA Enfeksiyon

  1. 9.1-9.3 olarak açıklandığı gibi hücrelere davranın.
  2. 0.01 viral parçacıkların / 24 saat 1 hücre ve inkübe bir enfeksiyon çokluğu HIV-1 ADA içeren MCSF olmadan istenilen günlerinde, bütün orta kaldırmak ve orta ile değiştirin. Viral orta çıkarın ve taze, virüssüz medya ile değiştirin. 10 gün boyunca Kültür hücreleri her gün yarım orta alışverişi ya da 6 (Şekil 5) hücreleri canlı tutmak için gerekli.
  3. On gün sonrası enfeksiyon, 96 plaka, 10, her iyi, yerden orta mcL toplamak ve mağaza -80 ° C retroviral (ters) transkriptaz analizi gerçekleştirmek için hazır olana kadar.

12. Reverse Transcriptase (RT) Testi

  1. Her 10 mcL örnek adım 11.3 ile 10, 100 mM Tris-HCl (pH 7.9), 300 mM KCl, 10 mM DTT,% 0.1 nonil phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40) ve su içeren bir çözüm mcL karıştırın. Bu karışımı, 37 ° C'de 7 15 dakika inkübe edin.
  2. i> Daha sonra 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl 2, 0.05% NP-40, 10 mikrogram / ​​ml poli (A), 0.250 içeren bir çözüm 25 mcL ekleyin 37 U / ml oligo d (T) 12-18, ve her iyi ve inkübe 10 μCi / ml 3 H-TTP ° C de 18 saat 7 için .
  3. Inkübasyon sonrasında buz% 10 trikloroasetik asit (TCA), her bir kuyunun 50 mcL ekleyin. Cam elyaf filtreler üzerine kuyuların Harvest ve β-sintilasyon spektroskopisi 7 3 H-TTP birleştirmek için filtreleri değerlendirmek.

13. HIV-1p24 Saptamalar

  1. Retroviral transkriptaz orta örneği PBS 3 kez 1 mL ile durulama adım 11.3 kaldırıldı çoğaltmak hücreleri yıkayın.
  2. 4 gece Fix% 4 paraformaldehid ile hücreleri ° C Ertesi sabah hücreleri 3 kez PBS ile durulayın.
  3. HIV enfeksiyonu görselleştirmek için fare monoklonal antikorlar (1:10, Dako, Carpinteria, CA), HIV-1 p24 kullanın. 40x objektif (Şekil 6) kullanarak parlak alanının altında Resim hücreleri.

14. Temsilcisi Sonuçlar:

Ilaç Boyut
(Nm)
PDI Ücret
(Mv)
Yüzeyaktif
IDV 1052 0,286 -24,58 % 0.5 'P188,% 5.0 SDS, 9.25% Sakkaroz
RTV 233 0,273 -7,47 % 0.5 'P188, 9.25% Sakkaroz
ATZ 840 0,192 +25,47 % 0.5 'P188, 0.1% MPEG 2000-DSPE, 1.0% DOTAP, 9.25% Sakkaroz
EFV 347 0,235 -13,52 % 1.0 PVA

NanoART Tablo 1: Fiziksel özellikleri
Tablo nanoART formülasyonlarının fiziksel özellikleri için potansiyel temsilcisi değerleri belirtilen yüzey kullanılarak üretilen görüntüler. Değerler ortalama çapı dağınık ışık yoğunluğu, polydispersity indeksi (PDI, partikül boyutu dağılımı tahmini), ve çeşitli nanoformulation örnekler için elde edilen zeta potansiyel değerleri dayalı içerir. Tabloda kullanılan kısaltmalar: IDV: İndinavir; RTV: ritonavir, ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodyum dodesil sülfat; P188: poloxamer 188 (aynı zamanda Pluronic F68 olarak adlandırılır), MPEG-2000-DSPE: metil-poli (etilen-glikol) 1,2-distearoyl fosfatidil-etanolamin; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 - [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoyl] - 3-trimethylammonium propan.

Şekil 1
ŞEKİL 1 nanoART üretiminde kullanılan çeşitli yöntemler özetleyen akış çizelgesi.
Şekil 1 nanoART üretimi için kullanılan çeşitli yöntemler özetlenmiştir. Akış şeması, ilgili yöntemleri kritik aşamalarında her zaman tahsis beklenen içerir.

Şekil 2
ŞEKİL 2 istenen ve istenmeyen NanoART morfolojisi Temsilcisi görüntüler. Tarama elektron mikroskobu RTV nanoART analizi (büyütme, 15.000 X) homojenizasyon, ıslak freze ve 0,2 mikron polikarbonat filtrasyon membran üst sonication üretti. Ölçü çubuğu tüm çerçeveler içinde, 2.0 mikron eşittir. İstenen nanoART, ortalama olarak, aynı ya da benzer bir şekle sahip olma eğilimindedir düzgün kenarlı küçük (≤ 2 mm) kendi kendine yeten parçacıklar oluşur. İstenmeyen nanoART, hem boyutu ve şekli çok farklıdır ve birbirlerine ve / veya sopa sigorta.

Şekil 3
ŞEKİL 3 arzu nanoART çözümü ve MDM nanoART alarak Görüntüler. Homojenize RTV-NP ve MDM Aydınlık alan mikroskobu görüntüleri (20x objektif kullanılarak elde) nanoART kaplıyor. Bir cam kapak kayma PBS 100 mcL RTV-NP çözümü 10 mcL birleştirerek sonra, parçacıklar görülebilir ve (A), bağımsız olarak tanımlanabilen büyük parçacıkları sadece birkaç kum benzerler. Image tamamen farklılaşmış ve nanoART tedavi (B) önce iğsi MDM. Hücrelerin nanoART çektikten sonra, bu rengi koyulaşabilir ve çekirdekleri nanoART perinükleer dağıtım nedeniyle daha belirgin hale, ancak onlar hala iğsi hücre gövdesi (C) korumak. Hücrelerin çekirdekleri, gizlenmiş haline nanoART aşırı haline ve yuvarlak hücreler iğsi yapısını kaybetme ve potansiyel olarak iyi (D) alt ayrılmakta.

4 "/>
ŞEKİL 4 MDM içine nanoART hücresel esas Onay. Transmisyon elektron mikroskobu (büyütme, 15.000 x), ıslak öğütme (B), (C) sonikasyon RTV-NP, ve tedavi edilmezse hücreleri (D homojenizasyon (A), RTV-NP RTV-NP maruz MDM içine nanoART alımı gösterir .) Hücreler içinde, nanoART geometrik şekli ile kolaylıkla tespit edilebilir. Kontrol hücresi (D) belirgin bir geometrik yapıları olmayışına dikkat edin. Her parçacığın bir örnek ana hatlarıyla: homojenizasyon için kırmızı (A), ıslak öğütme (B), yeşil (C) sonikasyon için mavi. Parçacık yapısı SEM ile görüldü ki benzer. Ölçü çubuğu tüm çerçeveler içinde, 5.0 mikron eşittir.

Şekil 5
ŞEKİL 5 nanoART antiretroviral etkinliğini test etmek için yöntemi diyagramı. HIV-1 ADA maruz sonra viral replikasyon MDM ilk nanoART ile tedavi edilmelidir inhibe ve nanoART yeteneğini test etmek için. ART serbest çalışmalara benzer şekilde, MDM nanoART ile yüklenir ve sonra içselleştirilmiş henüz herhangi bir partikülleri uzaklaştırmak için yıkanır. NanoART yüklü MDM sonra her gün bir yarım orta alışverişi ile 15 gün öncesine kadar kültüre edilmektedir. MDM bu sefer sırasında (genellikle gün 1, 5, 10 ve 15), HIV-1 ADA ile meydan . Her viral maruziyet hücreleri enfeksiyon ilerleme sağlamak amacıyla 10 gün süreyle kültüre sonra. Gün 10 sonrası enfeksiyon ortam örnekleri RT analizi ve p24 antijen için sabit ve boyanmış hücreler toplanır. Sigara nanoART tedavi MDM, enfekte olan ve olmayan, aynı zamanda kültürlü ve paralel olarak p24 antijeni ve RT aktivitesi varlığı için test edilmektedir.

Şekil 6
ŞEKİL 6 p24 boyanma HIV-1 ile enfekte MDM nanoART etkinliğinin test edilmesi. RTV-NP Parlak alan görüntüleri (20x amacı), 10 gün HIV-1 ADA ile meydan sonra MDM tedavi edilmelidir . Hücreleri virus1 gün sonrası nanoART tedavi (A) ile karşı karşıya iken enfeksiyon; çoğu hücreleri (A içerlek oklarla gösterilen) sitoplazma içinde NP varlığı dikkat. Bazı hücreler (inset B oklarla gösterilen) NP muhafaza varlığı, ancak unutmayın; Enfeksiyon hücreleri nanoART tedavi (B) 10 gün sonra virüse maruz edildiğinde çok daha az (D) nanoART tedavi edilmezse hücrelerine kıyasla daha az olmasına rağmen, mevcut oldu gün 1-nanoART sonrası tedavi (A İçerlek) daha az. Görüntü ne nanoART ne de bulaşmış (C) ile tedavi edilen hücrelerin hücre sitoplazma içinde NP dikkat eksikliği (C İçerlek). NanoART ile tedavi edilen, ancak HIV-1 ADA (D) maruz kalmayan hücrelerde Image .

VIDEO 1 MDM tarafından yoksul RTV-NP alımını hücre konfokal mikroskobi yaşayın. MDM Floresan mikroskopi Vybrant Dio hücre-etiketleme çözümü ile yeşil etiketli ve RTV-NP kırmızı etiketli ile tedavi. Bir görüntü 60x büyütme az 4 saat süreyle her 30 saniyede çekildi. videosunu izlemek için tıklayın

VIDEO 2 MDM tarafından başarılı RTV-NP alımını hücre konfokal mikroskobi yaşayın. MDM Floresan mikroskopi Vybrant Dio hücre-etiketleme çözümü ile yeşil etiketli ve RTV-NP kırmızı etiketli ile tedavi. Bir görüntü 60x büyütme az 4 saat süreyle her 30 saniyede çekildi. videosunu izlemek için tıklayın

Discussion

NanoART HIV-1 terapötikler geliştirmek için tasarlanmıştır. Biz klinik kullanım için bu teknolojiler geliştirmek için bir ilk adım olarak nanoformulated ilaç geliştirme için bir laboratuvar test sistemi olarak monosit-makrofaj bazlı bir ilaç dağıtım sistemi önerdi. Bizim geçmiş çalışmaları sistemi böyle bir uygulama 5,6 için geçerli olduğunu göstermiştir.

Cari rapor, HIV-1 yaygın olarak kullanılan ilaçlar (ritonovir RTV; efavirenz, EFV ve atazanavir, ATV indinavir IDV) NP sentezleme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ıslak öğütme, homojenizasyon ve ultrasonik sağlandı. Önemlisi, bizim yaklaşımımız nanoART fiziksel özellikleri, boyut, şekil ve şarj 5,6 gibi değişiklikler için izin verir . Yüzey dikkatli seçimi, bir nötr son derece olumlu, son derece olumsuz bir parçacığın şarj kontrol edebilirsiniz. Işlem süresi ve yoğunluğu değiştirerek, bir boyutu kontrolü ve ≥ 3 mm olarak ≤ 200 nm gibi küçük veya büyük parçacıklar hale. Parçacık şekli de diğer fiziksel özelliklerine göre daha az bir ölçüde kontrol altına alınabilir. Örneğin, küresel parçacıklar çok taraflı geometrik şekiller, ıslak öğütme ve homojenizasyon ile imal edilebilir polimerler ile sonication yoluyla yapılabilir. Islak öğütme ve homojenizasyon farklı şekilli parçacıklar üretmek, ancak bu sürecin fraksiyonasyon yöntemi bağımlı ve doğrudan kontrol edilemez. Bu özellikler üretim yöntemleri, araştırmalar tam tasarım özellikleri kolayca nanoART üretmek etkinleştirebilirsiniz. NanoART fizikokimyasal özellikleri, istikrar, gerek üzerinde güçlü bir etkisi var ve nasıl hücrelerle etkileşime beri Bu hayati önem taşımaktadır. Örneğin, biz nanoART, yaklaşık 1 mikron boyutunda olan güçlü bir pozitif yüke sahip bir multisided geometrik şekil makrofajlar tarafından bir kez hücrelerin içinde daha istikrarlı daha hızlı bir şekilde ele alınması ve daha uzun bir süre boyunca yayımlanan göstermiştir süresi 6.

Test nanoART için bir yöntem, alınacak parçacıklar yeteneği basit bir tarama için izin veren gelişmiş muhafaza ve viral replikasyon inhibe etme kapasitesine ek olarak, makrofajlar, HIV-1 ilkesini hedef hücreleri tarafından yayımlanan oldu. Bu kolaylıkla performansa dayalı nanoART farklılaştırmak ve beşeri nanoART gelişmekte verimlilik ve hız hem de artan, bu nedenle, in vivo modelde başarılı en iyi şans olduğunu tespit için sağlar.

NanoART ile ex vivo fare kemik iliği makrofajlar yüklenir ve adoptively humanize HIV-1 enfekte olmuş fareler, merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere, aktif enfeksiyon sitelerine seyahat ve serbest ilaçlar için 2 hafta içinde intravenöz enjeksiyon yoluyla transfer olduğu kanıtlanmıştır 2-4 viral replikasyon inhibe etmek. Buna ek olarak, bu nanoART yüklü hücreler de etkili plazma virüs bulaşmış hücrelerin sayısını azaltmak mümkün, hem de CD4 + hücreler 2 korumak gibi lenf düğümleri, dalak, karaciğer ve akciğer. Bu çalışmalar, ön rağmen, hücre-aracılı nanoART dağıtım sistemi, kan ve enfekte dokuların hem de klinik olarak anlamlı miktarda ilaç dağıtabilirsiniz göstermektedir. Çünkü HIV-1 enfekte fare çalışmalardan cesaret ön sonuçlar, şu anda, klinik kullanım için nanoART potansiyelini daha test etmek için bir maymun immün yetmezlik virüsünün enfekte makak modeli geliştiriyoruz.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 ve P01 NS43985 (HEG) tarafından da desteklenmiştir. Yazarlar eleştirel okuma yazması ve üstün grafik ve edebi destek için teşekkür ederim Bayan Robin Taş. Biz onun ıslak freze uzmanlık Steve Grzelak teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca tarama ve transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri sağlamak için, Nebraska-Lincoln elektron mikroskobu çekirdek tesisin Üniversitesi Dr Han Chen teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, canlı konfokal mikroskobi kullanarak onun uzmanlık için Megan Marquart teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
nanoART Manufacture
Indinavir sulfate Reagent Longshem Co., Shanghai, China Cas # 157810-81-6
Ritonavir Reagent China Shengda Pharmaceutical Company, China Cas # 155213-67-5
Atazanavir sulfate Reagent Gyma Laboratories of America INC Cas # 198904-31-3
Effavirenz Reagent Hetero Labs LTD, India Cas # 154598-52-4
PVA Reagent Sigma-Aldrich P 8136
SDS Reagent Bio-Rad 161-0301
Sucrose Reagent Fluka 84097
P188 Reagent Sigma-Aldrich P 1300
mPEG 2000-DSPE Reagent Genzyme LP-R4-039
Dotap Reagent Avanti Polar Lipid, Inc 890890 P
Hepes Reagent Sigma-Aldrich 83264
PLGA 75:25 Reagent Sigma-Aldrich P1941
Dichloromethane Reagent Acros Organics 75-09-2
Mannitol Reagent Sigma-Aldrich M9546
CTAB Reagent Sigma-Aldrich H 9151
Analytical Balance Tool Denver Instrument
T-18 Mixer Tool IKA
Ultra Sonicator Tool Cole-Parmer
Wet milling, MicroCer Tool Netzsch Fine Particle Technology, LLC
Homogenizer, EmulsiFlex-C5 Tool Avestin, Inc.
Zetapotentiometer Tool Malvern Instruments
Gas Manifold System Tool Victor Technologies
In Vitro Testing
DMEM Reagent Mediatech, Inc. 10-013-CV
Gentamicin Reagent Invitrogen 15710-064
Ciprofloxin Reagent Sigma-Aldrich 17850
Human MCSF Reagent Miltenyi Biotec 130-093-964
Pooled normal human serum Reagent Cole-Parmer WU-88061-68
6-well tissue culture plates Tool Corning 3524
Methanol (HPLC Grade) Reagent Fisher Scientific A452SK-4
1.7 ml microcentrifuge tubes Tool National Scientific Company CN1700GT
Glutaraldehyde solution Reagent Sigma-Aldrich 49632
Osmium tetroxide solution Reagent Sigma-Aldrich 75632
Centrifuge 5417R Tool Eppendorf 022621807
F-45-30-11 fixed angle rotor Tool Eppendorf 022636006
HIV-1ADA Reagent
HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody Reagent Dako M0857
Microscope slide cover slips Tool Fisher Scientific 12-548-5P

Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167, (4), 1428-1441 (1988).
  2. Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108, (8), 2827-2835 (2006).
  3. Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
  4. Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183, (1), 661-669 (2009).
  5. Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. (2010).
  6. Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4, (8), 903-917 (2009).
  7. Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146, (1), 298-306 (1991).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics