Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Кальций является вездесущий посланник в нервной системы, необходимой для запуска выпуска нейротрансмиттера и изменения в синаптической силы. Здесь мы показываем, технику для погрузки Са 2 +-индикаторы в терминалах дрозофилы нерва. Мы также демонстрируют изготовление необходимых приборов и подчеркнуть точки решающее значение для успеха этой техники.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Кальций играет много ролей в нервной системе, но ни один более впечатляющим, чем в качестве триггера для выпуска нейротрансмиттера, и никто более глубоким, чем в качестве посланника необходимо для синаптической пластичности, поддерживающего обучения и памяти. Для дальнейшего выяснения молекулярной основы Са 2 +-зависимые синаптических механизмов, модели требуется система, которая является и генетически ковкого и физиологически доступной. Дрозофилы предоставляет такую ​​модель. В этой системе, генетически закодированы люминесцентные индикаторы доступны для выявления Са 2 + изменения в нервных окончаниях. Тем не менее, эти показатели имеют ограниченные чувствительность к Са 2 + и часто показывают нелинейную реакцию. Синтетические люминесцентные индикаторы лучше подходят для измерения быстрых Са 2 + изменения, связанные с нервной активностью. Здесь мы показываем, технику для погрузки декстран-сопряженных синтетического Ca 2 + показатели в живых нервных окончаний у личинок дрозофилы. Особый акцент делается на тех аспектах протокол наиболее решающее значение для успеха этой техники, например, как избежать статических разрядов электричества вдоль изолированных нервов, поддержании здоровья подготовки в течение длительных периодов погрузки, а также обеспечение аксон выживание, предоставляя Са 2 + содействовать уплотнения разорвала окончаниях аксона. Низкое сродство декстран-сопряженных Са 2 +-индикаторы, такие как флуоресцентные-4 и rhod, доступны, которые показывают высокое отношение сигнал-шум в то время как минимально нарушая пресинаптических Са 2 + динамики. Декстран сопряжения помогает предотвратить Са 2 + показатели, поглощенных в органеллах типа митохондрий. Погрузка техника может быть применена в равной степени к личинки, эмбрионы и взрослых.

Protocol

  1. Выберите чистой блюдо рассечение, которое не подвергается какой-либо фиксаторов.

  2. Рассеките блуждающих 3-го возраста личинки дрозофилы Drosophila в Средние Шнайдера содержащие Са 2 + и L-глутамин, (не отрезайте любой нервы или волокон повреждения мышц № 7, 6, 13 или 12).

  3. Выберите стеклянный заполнения пипетки с 12 микрон наконечник (внутренний диаметр).

  4. Использование шприцев и трубки (для применения отрицательного давления на пипетку) обеспечить, чтобы кончик пипетки ничто не мешает.

  5. Выберите тонкой пластиковой заполнения нити, которые могут быть вставлены по всей длине стеклянной пипетки.

  6. Нарисуйте ~ 1 см 5 мМ декстран-сопряженных Са 2 +-индикатор в пластиковой нити.

  7. Вырезаны все сегменте нервы.

  8. Поддержка пипетки на рампе, которая позволит пипетки подойти к вентральной средней линии расчлененный личинки.

  9. Нарисуйте обрезанный конец нерва сегменте № 4, не щипать нервы, в конце пипетки (включая небольшое количество средних Шнайдера).

  10. Снимите трубку и вставить пластиковую нить в пипетку до конца нити в пределах 50 микрон разреза конца нерва (не дотрагиваясь до нерва).

  11. Извлечь достаточной Са 2 +-индикатор на нервные окончания увеличить объем среды Шнайдера примерно на 33% (конечная концентрация должна быть <2 мм). Важно - Это должно быть завершено в течение 5 минут после резки нерва.

  12. Место препарата в темноте при комнатной температуре в то время как нервные нагрузки.

  13. Через 40 минут удалите Са 2 +-индикатора с помощью нити.

  14. Оставьте пипетки на место и заполнить его полностью со средним свежие Шнайдера, так как это будет использоваться для применения стимулирующих импульсов нерва.

  15. Разрешить Са 2 +-индикатор, чтобы уравновесить в нерв, по крайней мере 60 минут, но не более чем на 4 часа, до начала Са 2 +-изображений.

  16. Промыть подготовки со средним свежие Шнайдера каждые 30 минут во время его уравновешивания.

  17. За 20 минут до визуализации заменить средний Шнайдера с гемолимфы-Like № 6 решения (HL6; Маклеод и др., 2002;. 2003).

  18. L-глутаминовой кислоты или глутамата может быть добавлен к HL6 решение на 7 мм, чтобы уменьшить чувствительность постсинаптических рецепторов глутамата, чтобы предотвратить нервные вызвало сокращение мышц (Маклеод и др., 2004;. Реифф и др., 2002;. 2005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics