칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

Biology

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Summary

칼슘은 시냅스 강도 신경 전달 물질 릴리스 및 변경 실행을위한 필수적인 신경 시스템에 유비 쿼터스 메신저입니다. 여기 + - 지표 Drosophila 신경 터미널에 칼슘이 로딩을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 또한 필요한 장치의 제조를 설명하고 기술의 성공을위한 중요한 포인트를 강조.

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Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

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Abstract

칼슘은 신경 계통에 많은 역할을 담당하고 있지만 신경 전달 물질 릴리스에 대한 트리거로보다 인상하고, 학습 및 메모리를 지원하는 시냅스 소성에 필수적인 메신저로서보다 그리하여 더 깊이 없음. 추가로 칼슘 2의 분자 토대를 명료하게하다하려면 + 종속적인 시냅스 메커니즘, 모델 시스템은 유전자 가단과 생리학에 액세스할 모두되어 있어야합니다. Drosophila melanogaster 같은 모델을 제공합니다. 이 시스템에서 유전자 인코딩 형광 표시기 신경 터미널에서 칼슘 2 + 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나 이러한 지표 칼슘 2 민감성을 제한 + 종종 비선형 응답을 보여줍니다. 합성 형광 표시기가 더 빠른 칼슘 2 + 신경 활동과 관련된 변화를 측정에 적합합니다. 여기 Drosophila의 유충에 살고 신경 터미널에 dextran - 복합 합성 칼슘 2 + 지표를로드하는 방법을 보여줍니다. 특정 강조 그러한 연장 로딩 기간 동안 준비의 건강을 유지, 절연 신경을 따라 정전기의 방전을 방지하는 방법으로 기술의 성공에 가장 중요한 프로토콜의 이러한 측면에 배치하고, 칼슘 2 제공하여 축삭의 생존을 보장합니다 + 절단 축삭의 엔딩의 씰링 추진. 낮은 친화력은 dextran - 복합 등 fluo - 4 및로드 '로 + - 지표, 칼슘 2 + 최소한 역학 presynaptic 칼슘 2 방해하면서 높은 신호 대 잡음 비율을 보여주 어떤 사용할 수 있습니다. Dextran - 활용은 + 표시가 같은 mitochondria로 organelles로 압수되는 칼슘 2 방지할 수 있습니다. 로딩 기법은 애벌레, 배아와 성인을 동등하게 적용할 수 있습니다.

Protocol

  1. 어떤 fixatives에 노출되지 않은 깨끗한 절개 요리를 선택합니다.

  2. 칼슘 2 포함 슈나이더의 Drosophila 매체에서 방황 제 3 instar Drosophila의 유충을 해부하다 +와 L - 글루타민 (모든 신경 손상이나 근육 섬유 Nos. 7, 6, 13 또는 12 깎지 않아.)

  3. 12 마이크론 팁 (내경)과 유리 필링 - 피펫을 선택합니다.

  4. 주사기와 튜브를 사용하면 (피펫에 부정적인 압력을 적용) 피펫 팁을 방해하지 않도록하십시오.

  5. 유리 피펫의 길이를 삽입할 수 고급 플라스틱 충전 - 필라멘트를 선택합니다.

  6. + - 표시기 플라스틱 필라멘트에 5 밀리미터 dextran - 복합 칼슘 2 ~ 1cm을 그립니다.

  7. 모든 세그먼트 신경 컷.

  8. 피펫 팁의 해부 유충의 복부 정중선 접근 수있는 램프에 피펫을 지원한다.

  9. 피펫의 끝 (슈나이더의 중간의 작은 금액을 포함)으로, 신경을 곤란하게하지 않고, 제 4 세그먼트에 신경의 절단 끝을 그립니다.

  10. 필라멘트의 끝부분이 (신경을 만지지 않도록) 신경의 절단 끝 50 미크론 이내 때까지 튜브를 제거하고 피펫으로 플라스틱 필라멘트를 삽입합니다.

  11. 꺼내기 충분한 칼슘이 33 % (최종 농도가 <2mM한다)의 슈나이더의 매체의 볼륨을 증가 종료 신경에 + - 표시. 중요 - 이것은 신경을 절단 5 분 이내에 완료해야합니다.

  12. 상온에서 어둠의 준​​비를 놓고 신경 부하 동안.

  13. 40 분 필라멘트를 사용하여 칼슘 2 + - 표시기를 제거한 후.

  14. 장소에 피펫을두고 이것은 신경에 자극 펄스를 적용하는 데 사용됩니다로서, 신선한 슈나이더의 매체로 완전히 채우십시오.

  15. 칼슘 2 + - 표시등이 최소 60 분 동안 신경 평형 수 있지만 더 이상 4보다 시간, CA 2 + 영상을 시작하기 전에.

  16. 신선한 슈나이더의 중간 30 분 간격으로 그것이 equilibrating하는 동안과 준비를 씻어.

  17. 이미징 전에 20 분 Hemolymph - 마찬가지로 6 번 솔루션 (; 맥레오드 ​​외​​ 2002;. 2003 HL6)와 슈나이더의 매체를 대체합니다.

  18. L - glutamic 산성 또는 글루 탐 산염은 신경 evoked 근육 수축 방지하기 위해 postsynaptic 글루 탐 산염 수용체를 감도를 줄이다하는 7mM에서 HL6 솔루션에 추가할 수 있습니다 (맥레오드 ​​외​​를 2004;. 레이프 외가 2002;. 2005).

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

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References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

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