씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

Biology
 

Summary

극지 지질 추출물의 조성과 개별 glycerolipids의 지방산 조성은 간단하고 강력한 지질 프로파일 실험에서 결정됩니다. 이를 위해 glycerolipids는 얇은 층 크로마 토그래피에 의해 격리되고 그들의 아실 그룹의 transmethylation를 받게. 지방산 아실 methylesters는 기체 - 액체 크로마 토그래피에 의해 계량입니다.

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Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518, doi:10.3791/2518 (2011).

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Abstract

환경에서 생물 세포막 분리 세포. 이러한 phosphatidylcholine 또는 phosphatidylethanolamine, 셀과 주변 사이의 화학 교류 모두 경계와 인터페이스 역할을 양식 이중층의 점막과 같은 다세포 식물과 동물, glycerolipids에 하나의 세포에서. 동물과 달리 식물 세포는 광합성을위한 특별한 organelle, 엽록체 있습니다. monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4 : 엽록체의 복잡한 멤브레인 시스템 즉 고유 glycerolipids 인이 부족해 glycolipids가 포함되어 있습니다. 이러한 lipids의 역할은 단순히 구조적인 이상입니다. 이러한 glycolipids 및 기타 glycerolipids는 photosystem I 및 II는 광합성 8,11에서 glycerolipids의 참여를 나타내는의 결정 구조에서 발견되었습니다. 인산염 기아 동안 DGDG는 phospholipids 9,12의 손실을 보상하기 위해 extraplastidic 세포막로 전송됩니다.

대부분 이러한 lipids의 생합성 및 기능을 우리의 지식은 Arabidopsis thaliana의 14 유전과 생화 학적 연구의 조합에서 파생되었습니다. 이러한 연구하는 동안, 북극 lipids의 분석을위한 간단한 절차는 지질 돌연변이의 검사 및 분석을위한 필수되었으며 자세하게 설명됩니다. 잎 지질 추출물 먼저 얇은 층 크로마 토그래피 (T​​LC)로 구분되며 glycerolipids는 요오드 증기로 reversibly 스테인드 있습니다. 개인 lipids은 TLC 판에서 스크랩한 및 불꽃 이온화 검출 (FID - GLC) (그림 1)과 함께 기체 - 액체 크로마 토그래피로 분석 아르 지방산 아실 methylesters (FAMEs)로 변환됩니다. 이 방법은 돌연변이 검사에 대한 안정적인 도구로 입증되었습니다. 예를 들어, tgd1, 2,3,4 endoplasmic reticulum - 투 - plastid 지질 인신 매매 돌연변이가 비정상 galactoglycerolipid의 축적을 기반으로 발견되었습니다 : trigalactosyldiacylglycerol (TGDG)와 18시 3분의 상대적 금액이 감소 (탄소 더블 채권) 멤브레인 lipids 3,13,18,20의 지방산 아실 그룹. 이 방법은 기판을 6으로 lipids를 사용하여 단백질의 효소 활동을 결정하는 적용됩니다.

Protocol

1. 지질 추출

  1. 한천의 성장 식물에서 4 주 된 Arabidopsis 잎 중간이나 흙을 확정하고 1.5 ML의 폴리 프로필렌 반응 튜브에 그들을 전송 30 MG를 수확하여 지질 추출을 시작합니다. 신선한 잎은는 플래시 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다
  2. , 클로로포름과 개미의 산성 (20시 10분 1초, V / V / V) 각 시료에 메탄올로 구성된 용매 300 μL 추출을 추가합니다. 5 분 (페인트 통 또는 이와 유사한 사용) 적극적으로 흔들어.
  3. 0.2 M의 인산 (H 3 PO 4), 1 M의 칼륨 염화물 (KCl)와 소용돌이 간략 150 μL를 추가합니다.
  4. 1 분 실온에서 13,000 XG에서 원심 분리기. 낮은 클로로포름 단계에 녹아있는 Lipids는 TLC 플레이트에 발견됩니다.

2. 얇은 레이어 크로마 토그래피 (TLC) 15

  1. 잠수함 0.15 M의 암모늄 황산 ((NH 4) 2 SO 4) 용액에 30 초에 대한 스트립을 읽어와 20cmx20cm 실리카 겔 코팅 TLC 판을 TLC 번호판을 준비하려면 30 초 동안 잠수함이 잠수 후 최소 2 일 동안 번호판을 건조 대상 컨테이너. 인증하는 동안 암모늄의 승화는 다른 glycerolipids로부터 분리에 필요한 phosphatidylglycerol을 protonates 황산, 뒤에 잎.
  2. 실험 당일, 활성화 120에서 오븐에 굽고하여 번호판을 TLC 2.5 시간에 대한 ° C.
  3. 상온에 활성 접시를 냉각 후, 크로마토 그램의 기원에 접시에 걸쳐 직선 (접시의 가장자리에서 1.5 cm)을 그리는 연필을 사용합니다.
  4. 펌 두건에서, 천천히 N 2의 느린 흐름에 따라 200 μL 노란색 플라스틱 팁을 20 μL 피펫을 사용하여 낮은 클로로포름 단계 3 X에게 지질 추출물 20 μL를 제공합니다. 이를 위해 Tygon 튜빙은 N 2 탱크 조절기에 연결되어 있습니다. 지름 1cm보다 작은 자리를 유지. 각 판은 10 샘플 (후속 GLC 분석이 계획되어 경우)까지 저장할 수 있습니다.
  5. 지방질이 퓸 후드 완전히 건조 명소로서, 아세톤, 톨루엔, 물 (: 30 ML : 7.5 ML 91 ML)로 구성된 개발 용매를 준비합니다. 주위 공기 상대 습도가 높으면 분리에 영향을 수 있습니다. 원하는 분리를 달성하기이 경우 물을 (7.0 ML : : 30 ML 91 ML)를 제공하기 위해 감소되어야합니다.
  6. 아래로 향하게 샘플 엔드와 탱크에 장소 플레이트 챔버 (H : W = 27.0 : 26.5 7.0 cm / cm / cm L) 개발 sealable TLC에 용매 개발 80 ML 하거라. 클램프를 사용하여 탱크를 밀봉합니다. 솔벤트는 접시를 계승하고 lipids가 분리됩니다. 개발 시간은 실온에서 약 50 분 거리에 있습니다.
  7. 용매 전면 판의 상단에서 1cm에 도달했습니다 때, 신중하게 탱크에서 접시를 제거하고 약 10 분 퓸 후드 완전히 건조.
  8. TLC로 구분 Lipids도 reversibly 정량 분석​​ 또는 황산 또는 α - 나프톨와 irreversibly 스테인드에 대한 요오드와 함께 간략하게 물들일 수 있습니다.
    1. 황산의 차링 : 15 분 (그림 2A) 120 ° C에서 퓸 후드 구워에서 유리 스프레이 병에 물이 50% 황산과 스프레이 접시.
    2. glycolipids에 대한 α - 나프톨 얼룩 : 120 ° C에서 2.4 % (W / V) 10 % α - 나프톨 (V / V) 황산, 80 % (V / V) 에탄올 구워 함께 접시에 스프레이 3-5위한 glycolipid 밴드까지 분 (그림 2B) 분홍색이나 보라색 얼룩이 있습니다. Overtreatment은 시약에 황산의 존재로 인해 모든 lipids의 차링으로 이어질 것입니다.
    3. 요오드 얼룩 : 퓸 후드에 요오드 결정이있는 폐쇄 TLC 탱크 (lipids 볼 때까지 요오드 증기와 분위기의 채도로 이어지는 하단에 트레이)에 접시를 놓습니다. 너무 오래 요오드가 covalently 고도 불포화 지방산 (그림 2C)을 수정할 수 있으므로 요오드에 접시를 노출시키지 마십시오. 또는, 샘플 차선과 interspersed는 표준 차선이 유리 울 N 2는 각각 표준 차선 이상의 폭격을 받았고이를 통해 요오드 결정과 파스퇴르 피펫을 연결을 사용하여 스테인드해야 lipids의 산화를 방지합니다.

3. 지방산 아실 Methylester (명성) 반응 16

  1. 면도날과 TLC 판에서 실리카 주변 식별 지질 명소를 제거합니다. 지질이 포함된 실리카을 다쳤고과 테플론 (PTFE) - 줄지어 나사 마개와 유리관에 깔때기를 사용하여 실리카 분말을 전송할 수 있습니다.
  2. 유리 피펫 각 샘플에 무수 메탄올 1 ML 1 N 염산 (HCL)을 추가합니다.
  3. 200 μL 노란색 플라스틱 팁과 200 μL 피펫을 사용하여 내부 표준으로 각각의 시료 200 μL 피펫을 사용하여 100 μL 50 μg ML -1 pentadecanoic 산성 (15시)를 추가합니다. 튜브 컨트롤로 methanolic HCL에서만 pentadecenoic 산성과 함께 보관하십시오. 테플론 - 줄지어 모자와 밀접하게 유리 튜브를 닫습니다.
  4. 부화 GL25 분 80 ° C의 물을 욕조에 엉덩이가 튜브. 용매가 증발하지 않도록 튜브 봉인해야합니다.
  5. 튜브가 냉각되면 적극적으로 한 ML의 헥산과 와동 다음 1 ML 0.9 %의 나트륨 염화물을 추가합니다. 3 분 1000xg에서 샘플을 원심 분리기.
  6. 펌 모자, 파스퇴르 피펫으로 시료의 헥산 / 상위 레이어를 제거하고 새로운 13x100 mm의 유리관에 넣습니다.
  7. 완전히 건조하지 않고 N 2의 느린 흐름에 따라 헥산을 증발.
  8. 60 μL 헥산의 결과 지방산 아실 methylesters s를 디졸브. autosampler 튜브와 긴밀하게 모자에 샘플을 전송합니다. 샘플 ° C 단기 및 -20 ° C에 대한 몇 일 동안 4 저장할 수 있습니다.

4. 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC) 10

  1. GLC를 시작하기 전에, 헬륨, 수소와 공기 실린더가 가득 있는지 확인합니다.
  2. 충분한 헥산은 용매 저수지에 추가되어야하고 폐기물 컨테이너가 비어 있어야합니다. 지방산 아실 methylesters 분리 들어, 시스템에 DB - 23 컬럼을 연결합니다.
  3. autosampler에 플레이스 유리병. 시스템 컴퓨터에 GLC에 대한 Chemstation 소프트웨어를 시작합니다.
  4. 250 ° 헬륨 유량 48.6 ML 분 -1에서 속도와 21.93 PSI의 압력 C.에서 입구 온도를 설정 분할 비율은 30.0입니다 : 1.
  5. 오븐 온도는 2 분 140 ° C에서 초기 설정 ° C 25 ° C 분 -1의 속도로 160 증가합니다. 다음 160의 증가로 온도를 설정할 ° C 250 ° C 8 속도 ° C 분 -1 250에서 개최 ° 140 감소 뒤에 4 분에 대한 C ° C 38 ° C 비율 분 - 1. 하나의 실행 약 21 분 정도 소요됩니다.
  6. 불꽃 이온화 검출기의 온도는 270입니다 ° 30.0 ML 분 -1, 400 ML 분 -1과 헬륨 유량 30.0 ML 분 -1시에서 공기 흐름 속도의 수소 유량과 C.
  7. 튜브 및 실행 시퀀스 테이블에 샘플 이름의 번호를 입력합니다. 유리병 당 2 μL 시료를 주입하기 위해 10 μL 주입기를 설정합니다.
  8. 악기가 준비되면, 실행 순서를 시작합니다.

5. 대표 결과 :

4 주 된 Arabidopsis의 모종의 TLC로 구분 lipids의 돌이킬 수없는 얼룩의 예는 그림 2에 표시됩니다. 황산 스테인드 lipids (그림 2A)가 탄과 갈색 반점으로 나타납니다 있습니다. α - 나프톨 다른 극지 lipids은 (그림 2B) 노란색 얼룩 동안 α - 나프톨은 분홍색 - 보라색 색상을 가지고 물들일 등 Glycolipids을 SQDG, DGDG 같은 MGDG 같은 glycolipids을 얼룩이 좋습니다. 요오드 얼룩도 가능해과 lipids에게 요오드 증발 (그림 2C)로 짧은 시간이 지남에 따라 사라집니다 노란 색상을 제공합니다. 흠없는 lipids가 lipids의 분해 감소 것이 바람직 있지만 간단히 요오드 스테인드 lipids는 GLC 분석의 대상이 될 수 있습니다.

성공적으로 완료하면, 다른 지방산 아실 methylester를 나타내는 독특한 신호는 (그림 3) GLC 후 관찰됩니다. 짧은 탄소 사슬과 적은 더블 채권과 지방산 아실 methylester은 DB - 23 컬럼을 사용하여 짧은 체류 시간이 있습니다. 지방산 아실 methylester 프로 파일링이 변경 지질 성분과 돌연변이를 식별하는 중요한 도구입니다. 그림 4에서 MGDG18 : 3 지방산 어금니 비율은 야생 유형 18 비교 tgd4 - 1 돌연변이 감소됩니다. 모든 지질 클래스의 몰스 하나의 지질 클래스 지방산 아실 methylester의 몰스을 나누어 각 지질의 어금니 비율 계산됩니다. 예를 들어, MGDG의 어금니 비율을 계산 :

(MGDG) 몰 %는 = Σ [FAMEs (MGDG)] / Σ [FAMEs (총)] x100의 %

야생 유형과 돌연변이 모두에서 각 지질 클래스의 결과 어금니 비율을 비교할 수 있습니다. 예를 들어, tgd4 - 1 돌연변이 MGDG와 PG의 상대적인 양의 증가하지만 DGDG 및 PE (그림 5) 18 양을 감소했다.

그림 1
Arabidopsis 모종을 사용하여 극성 지질 분석 그림 1. 플로우 차트. 총 lipids 4 주 된 Arabidopsis의 모종에서 추출한 및 TLC로 구분됩니다. 구분 lipids는 GLC 분석 다음 transesterification에 대한 TLC 플레이트에서 까진 수 있습니다.

그림 2
그림 2. TLC 플레이트에 lipids의 분리. 35 MG의 지질 추출물는 (신선한 무게) 야생 유형 모종은 TLC로 구분하여 황산 (A), α - 나프톨 (B) 또는 요오드 증기 (C)로 물들어있다. 세 반복은 각 얼룩 방법으로 표시됩니다. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, phosphatidylcholine, PE, phosphatidylethanolamine, PG, phosphatidylglycerol, PI, phosphatidylinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.

그림 3
그림 3. 지방산 Methylesters의 GLC 분석 (FAMEs)은 야생 유형의 MGDG에서 파생. FAMEs는 30m 모세관 컬럼을 분리하여 불꽃 이온화에 의해 감지됩니다. Pentadecanoic 산성 (15시)는 내부 표준으로 사용됩니다.

그림 4
그림 4. 야생 유형 Col2 (흰색 열)과 tgd4 - 1 돌연변이 (검은 열)에 MGDG의 지방산 프로파일. 지방산은 이중 채권의 수에 따라 탄소의 번호로 제공됩니다. 세 반복은 평균이며, 표준 편차가 표시됩니다.

그림 5
그림 5. 야생 유형 Col2 (흰색 열)의 폴라 lipids 구성 및 tgd4 - 1 돌연변이 (검은 열). 세 반복은 평균이며 표준 편차는 오류 막대로 표시됩니다.

Discussion

GLC와 TLC 결합하여 식물의 극지 lipids의 정량 분석​​을위한 강력하고 신속한 도구를 제공합니다. 지질 구성에 약간의 변화는 확인할 수 있으므로이 방법은 북극 지질 대사 경로 1,20에서 장애인 돌연변이의 대규모 심사에 사용되고 있습니다. 이 방법은 널리 기판으로 극지 lipids을 이용한 효소의 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 2,6,7

단풍 게다가, 같은 뿌리와 씨앗이나 chloroplasts 및 mitochondria와 같은 subcellular 분수와 같은 다른 식물 조직의 지질 조성도 같은 방법으로 결정하실 수 있습니다.

여기에 사용되는 용매 시스템 (아세톤, 톨루엔, 물) 공장에서 glycolipids 및 phospholipids의 분리에 최적입니다. tetragalactosyldiacylglycerol는 PC에서 실행하는 동안 그러나, tgd1, 2,3,4 돌연변이 및 절연 chloroplasts에서 TGDG은 PE와 함께 실행됩니다. 이 경우에는 클로로포름, 메탄올, 초산과 물 (85 : 20 : 10 : 4, V / V / V / V)와 용매 시스템은 13 사용됩니다. 때로는 두 개의 서로 다른 용매 시스템을 사용하여 2 차원 TLC은 추가 별도의 glycolipids 및 phospholipids 19 수행됩니다. 또한, 식물의 조직 직접 TLC 5 초기 분리하지 않고 전체 지방산 프로파일을 결정하는 GLC 다음 명성 반응을 받다 수 있습니다. 시연 TLC - GLC 시스템 게다가, 지질 프로파일에 사용되는 다른 방법은 직접 전기 분무 이온화 질량 분석계 협동 17 기반으로합니다. 이 방법에서는 추출에 lipids의 초기 색층 분리가 생략됩니다. 그러나,이 방법은 실험실이나 돌연변이 검사에 대한 일상적인 분석을 위해 덜 유용하게 고가의 장비와 숙련된 인력을 필요로합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 작품은 미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 크리스토프 베닝을 부여하여 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-naphthol Sigma-Aldrich N1000
Methanolic HCL 3N Sigma-Aldrich 33050-U Dilute to 1N by methanol
Si250-PA TLC plates JT Baker 7003-04 With pre-absorbent
TLC chamber Sigma-Aldrich Z266000
Screw cap tubes VWR international 53283-800
Scew caps Sun Sri 13-425
PTFE disk Sun Sri 200 608
GLC system Hewlett-Packard HP6890
DB-23 column J&W Scientific 122-2332
GLC vials Sun Sri 500 132
Caps of GLC vials Sun Sri 201 828
Chemstation software Agilent Technologies G2070AA

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References

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Comments

9 Comments

  1. Dear All:
    There is something that intrigues me about your protocol, why is formic acid added to the meAdd 300 μL extraction solvent composed of methanol and phosphoric acid added to 1 M potassium chloride (KCl) for the lipid washing part? is this to eliminate contribution of chlorophyll ?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2011 - 10:24 AM
  2. It is to kill lipases and prevent breakdown of lipids due to lipase action during extraction.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2011 - 10:39 AM
  3. Dear Sir ,
    your presentation is very nice, fruitful, Whether i can use the same method for microalgae lipid extraction. how to understand different lipids or fatty acid from the thin layers ..i mean the names. please give a good solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 6:23 AM
  4. Hello,

    Thanks for the question. If there's existing knowledge about the lipid profile of this microalgae, you can simply identify the major lipids on the TLC plate by the relative abundance. You can also use α-naphthol staining to determine the sugar-containing lipids. If it's green algae, the most abundant lipids must be MGDG and DGDG. On the other hand, if no previous knowledge about the lipid profile, scrap off each band after iodine staining and re-extract the lipid with chloroform. Use Mass Spec to determine the identity of each lipid.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 11:52 AM
  5. Dear Sir ,
    thanks for your fruitful presentation.can i use triheptadecanoin as internal standard instead of pentadecanoic acid?How to make sure that the lipid is completely converted into fatty acid methyl ester?

    Reply
    Posted by: wang h.
    March 14, 2013 - 1:43 AM
  6. Hello Dr. Wang,

    To answer your question, you can use triheptadecanoin as internal standard as long as your sample dŒsn't have heptadecanoic acid, which most biological systems don't. But you must make sure to add it before the FAME reaction. Since triheptadecanoin has three C17 FA esterified on a glycerol backbone, during FAME reaction, three molecules of C17 methyester are generated. Therefore during final quantification, you need to divide the molar concentration by 3.
    Regarding the conversion rate of FAMEs, there is no absolute guarantee that all lipids are converted and it is unnecessary because if the internal standards and the samples are treated in parallel, the degree of conversion should be identical.
    I hope this answers your question and let me know if you have any other questions regarding this protocol. Good luck with your experiments!

    Reply
    Posted by: Zhen W.
    March 14, 2013 - 12:17 PM
  7. Dear All,

    Thanks for your nice presentation, it is very helpful. Actually now I am trying to apply this method on green algae, and I got a question regarding the lipid extraction. Our samples are flash frozen in liquid nitrogen and lyophilized, do you think there will be much difference of the result between fresh and lyophilized sample? Do we need to add water to our sample before the extraction? Thanks again!

    Reply
    Posted by: Yan M.
    May 14, 2013 - 2:43 PM
  8. Dear Yan,

    Theoretically, there is no difference between fresh and lyophilized algal sample in terms of lipid extraction. Just be careful during the lyophilization and store in -80C afterward, if not using immediately. If enzymes in cell are not totally deactivated or sample is exposed in room temperature for a long time, unsaturated fatty acids in lipid sample would be easily degraded. There's no need to add water before extraction.

    Good luck with your experiment!

    Bensheng L. and Zhen. W

    Reply
    Posted by: Zhen W.
    May 14, 2013 - 9:22 PM
  9. Thanks for your kind reply. Now we are moving to the step of iodine staining, could you please let me know usually how much iodine is needed to create a saturation of the atmosphere with iodine vapor? We have a similar tank as you showed in the video. Btw, the multiple-plate holder in the tank you showed in the video looks really nice, could you please let me know where did you get this? I searched online but failed to find the proper size. Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Yan M.
    June 28, 2013 - 4:59 PM

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